ポリAポリメラーゼの構造基盤

聚腺苷酸聚合酶的结构基础

基本信息

批准号：
18770101
负责人：
須藤恭子
金额：
$ 2.37万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770101/
关键词：
構造生物学核酸蛋白質酵素

项目摘要

生体内における核酸の伸長反応において,DNAあるいはRNA合成酵素は,一般的に核酸性の鋳型を用いてそれに相補的な配列を合成する。ポリAポリメラーゼ[Poly(A)polymerase]は,鋳型として核酸を用いることなく,決まった配列を付加・伸長する。ポリAポリメラ-ゼは,そのアミノ酸配列の相同性から,真核生物由来のポリAポリメラーゼのグループと真正細菌由来のポリAポリメラ-ゼのグループに分けられる。現在までに真核生物ポリAポリメラーゼのX線結晶構造解析は行われているが,真正細菌由来のポリAポリメラーゼの構造は未だに決定されていない。本研究では,真正細菌由来のポリAポリメラーゼを題材として,構造を基にした生化学的手法により,この酵素が鋳型を用いずにRNAを合成する分子機構を明らかにすることを目的としている。申請者は,前年度に大腸菌および緑膿菌由来のポリAポリメラーゼ結晶化を試みたが,良い結晶は得られなかった。今年度は,同じく真正細菌に属するChromobacterium由来のポリAポリメラvゼと,GeobactOr由来のポリAポリメラーゼについて,クローニングと大量発現,精製を行い,結晶化のスクリーニングを行った。しかし,良い結晶は析出しなかった。昨年,今年度と,4つの菌に由来するポリAポリメラ-ゼを扱ったが,いずれもやや溶解度が低いという特徴があったため,結晶が得られないのではないかと考えた。そこで,大腸菌のポリAポリメラーゼを使って,溶解度の高いコンストラクトの作成を試みた。その結果,C末欠損mutantよりも,tagの位置の変更が効果的で,最終的には溶解度が10mg/mlを超えるコンストラクトが得られた。このコンストラクトを使用して,結晶化のスクリーニングを行った。

在体内核酸的扩展反应中，DNA或RNA合酶通常使用核酸酸性模板合成互补序列。聚（A）聚合酶在不使用核酸作为模板的情况下添加并扩展了固定序列。由于其氨基酸序列同源性，可以将Polya聚合酶分为真核Polya聚合酶和Eubacterial Polya聚合酶。迄今为止，已经对真核聚聚合酶的X射线晶体学分析进行了，但是尚未确定Eubacterial Polya聚合酶的结构。这项研究旨在阐明该酶通过使用基于结构的生化技术（使用源自Eubacteria的Polya聚合酶）合成RNA的分子机制。申请人试图在上一年从大肠杆菌和铜绿假单胞菌中结晶多A聚合酶，但没有获得良好的晶体。今年，也属于Eubact的铬细菌中的多A聚合酶被克隆，很大程度上表达，纯化和筛选以进行结晶。但是，没有良好的晶体沉淀。去年，今年，我们处理了来自四种细菌的聚丙酸聚合酶，并且由于它们的特征是溶解度略低，因此我们认为不会获得晶体。因此，我们尝试使用来自大肠杆菌的多A聚合酶创建高度溶解度构建体。结果，更改TAG位置比C末端突变体更有效，最终获得了超过10 mg/ml的溶解性的构建体。该结构用于筛选结晶。