ポリAポリメラーゼの構造基盤

聚腺苷酸聚合酶的结构基础

基本信息

批准号：
18770101
负责人：
須藤恭子
金额：
$ 2.37万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770101/
关键词：
構造生物学核酸蛋白質酵素

项目摘要

生体内における核酸の伸長反応において,DNAあるいはRNA合成酵素は,一般的に核酸性の鋳型を用いてそれに相補的な配列を合成する。ポリAポリメラーゼ[Poly(A)polymerase]は,鋳型として核酸を用いることなく,決まった配列を付加・伸長する。ポリAポリメラ-ゼは,そのアミノ酸配列の相同性から,真核生物由来のポリAポリメラーゼのグループと真正細菌由来のポリAポリメラ-ゼのグループに分けられる。現在までに真核生物ポリAポリメラーゼのX線結晶構造解析は行われているが,真正細菌由来のポリAポリメラーゼの構造は未だに決定されていない。本研究では,真正細菌由来のポリAポリメラーゼを題材として,構造を基にした生化学的手法により,この酵素が鋳型を用いずにRNAを合成する分子機構を明らかにすることを目的としている。申請者は,前年度に大腸菌および緑膿菌由来のポリAポリメラーゼ結晶化を試みたが,良い結晶は得られなかった。今年度は,同じく真正細菌に属するChromobacterium由来のポリAポリメラvゼと,GeobactOr由来のポリAポリメラーゼについて,クローニングと大量発現,精製を行い,結晶化のスクリーニングを行った。しかし,良い結晶は析出しなかった。昨年,今年度と,4つの菌に由来するポリAポリメラ-ゼを扱ったが,いずれもやや溶解度が低いという特徴があったため,結晶が得られないのではないかと考えた。そこで,大腸菌のポリAポリメラーゼを使って,溶解度の高いコンストラクトの作成を試みた。その結果,C末欠損mutantよりも,tagの位置の変更が効果的で,最終的には溶解度が10mg/mlを超えるコンストラクトが得られた。このコンストラクトを使用して,結晶化のスクリーニングを行った。

在体内核酸的延伸反应中，DNA或RNA合酶通常使用核酸模板来合成互补序列。 Poly(A) 聚合酶在不使用核酸作为模板的情况下添加并延伸指定的序列。根据其氨基酸序列的同源性，polyA聚合酶可分为源自真核生物的polyA聚合酶组和源自真细菌的polyA聚合酶组。迄今为止，已经对真核polyA聚合酶进行了X射线晶体结构分析，但真细菌polyA聚合酶的结构尚未确定。本研究的目的是以真细菌来源的多聚A聚合酶为研究对象，采用基于结构的生化方法来阐明该酶在不使用模板的情况下合成RNA的分子机制。申请人在前一年曾尝试对源自大肠杆菌和铜绿假单胞菌的polyA聚合酶进行结晶，但未能获得良好的晶体。今年，我们对来自也属于真细菌的色杆菌的多聚A聚合酶和来自GeobactOr的多聚A聚合酶进行了克隆、大量表达、纯化和结晶筛选。然而，没有沉淀出好的晶体。去年和今年，我们研究了来自四种细菌的多聚A聚合酶，但它们都具有溶解度稍低的特点，这导致我们怀疑无法获得晶体。因此，我们尝试使用大肠杆菌polyA聚合酶创建高度可溶的构建体。结果表明，改变标签位置比C端缺失突变体更有效，最终获得了溶解度超过10 mg/ml的构建体。该构建体用于进行结晶筛选。