超高感度化学発光検出によるmRNAのマイクロアレー解析

使用超灵敏化学发光检测对 mRNA 进行微阵列分析

基本信息

批准号：
14011241
负责人：
甲斐雅亮
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011241/
关键词：
mRNA DNA マイクロアレー化学発光検出ハイブリダイゼーション遺伝子

项目摘要

本研究では、核酸のハイブリダイゼーションアッセイおいて分子数レベルのmRNAの検出を可能にする新手法を開発することを目的としている。そこで本研究では、当研究室で既に見い出している核酸の新しい発光試薬TMPGによる化学発光反応を適用して、特定遺伝子テロメアの高感度ハイブリダイゼーションアッセイ検出法の開発研究を行った。TMPG試薬はグアニン塩基を特異的に発光性に導くので、グアニン塩基を含まないテロメアのcDNA[(CCCTAA)n]を膜に固定し、テロメアDNAとハイブリダイズさせれば、テロメアDNAを特異的に検出できるものと想定した。さらに、この方法では、ゲノムDNAを電気泳動せずに直接テロメアDNAを測定することが可能で、細胞分裂によって短縮するテロメアDNAの長さに応じて、それに比例した発光シグナルを得ることも期待できた。そこで、TMPG試薬によるテロメアDNAのハイブリダイゼーションアッセイ系の感度を増大させるために、アビジンタンパク質とピオチン化長鎖DNAを用いて、テロメアDNAのシグナル増幅反応について検討した。これはTMPG試薬の特性を活かした増幅反応で、ターゲットDNAにさらに多量のグアニン塩基を含む長鎖DNAを連鎖的に結合させ、発光強度を増大させることを期待したものである。検討の結果、ハイブリダイゼーションアッセイによるテロメアの検出感度を約千倍増幅することが可能であった。これにより、mRNAや特定DNAのマイクロアレー解析に対する新規の超高感度化学発光検出法の開発が期待できる。

本研究的目的是开发一种新方法，能够在核酸杂交测定中在分子水平上检测 mRNA。因此，在本研究中，我们利用本实验室已发现的新型核酸发光试剂TMPG，应用化学发光反应，开发了一种高灵敏度的特异性基因端粒杂交检测方法。 TMPG试剂特异性地使鸟嘌呤碱基发光，因此推测如果将不含鸟嘌呤碱基的端粒cDNA[(CCCTAA)n]固定在膜上并与端粒DNA杂交，则可以特异性地诱导端粒DNA。检测到。此外，利用该方法，可以直接测量端粒DNA而不需要对基因组DNA进行电泳，并且预期可以获得与因细胞分裂而缩短的端粒DNA的长度成比例的发光信号。因此，为了提高使用TMPG试剂的端粒DNA杂交检测系统的灵敏度，我们研究了使用亲和素蛋白和碘化长链DNA的端粒DNA的信号放大反应。这是利用TMPG试剂特性的扩增反应，通过将含有大量鸟嘌呤碱基的长链DNA与目标DNA连接起来，有望提高发光强度。研究结果表明，杂交检测端粒检测的灵敏度可提高约 1,000 倍。这可能会导致新的超灵敏化学发光检测方法的开发，用于 mRNA 和特定 DNA 的微阵列分析。