マイクロチップ上の遺伝子及びタンパク質の検出に用いる超高感度発光プローブの創製

创建用于检测微芯片上的基因和蛋白质的超灵敏发光探针

基本信息

批准号：
06F06229
负责人：
甲斐雅亮
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、細胞内で発現している極微量の核酸遺伝子やタンパク質の多型を網羅的に解析できる、新しい超高感度分子プローブの開発を目的としている。本年度は、膜上のアビジン類タンパク質を特異的に検出できるプローブの創製を目指して、新規発光性核酸プローブの合成研究を計画した。具体的には、大腸菌2本鎖DNAを基本骨格に持ち、分子内に多数のイソルミノールおよびビオチンを結合させた、新規化学発光性DNAプローブを合成した。その結果、市販のイソルミノール化試薬およびビオチン化試薬を用いて非常に簡便な操作で合成でき、かつエタノール沈殿のみで精製できることが分かった。このDNAプローブの化学発光強度を調べたところ、非常に強い発光を示すことを見出した。また、プロテインチップへの応用を考慮し、PVDF膜に吸着させたアビジン類タンパク質に対するDNAプローブの結合能を評価したところ、DNAプローブとアビジン類タンパク質の特異的結合、およびDNAプローブがアビジンを介して連鎖複合体を形成することが確認できた。本法によるビオチンおよびイソルミノール標識化を核酸アプタマーに応用できれば、検体タンパク質に結合したアプタマーを起点として、検体タンパク質に結合していないアプタマーがビオチンを介して連鎖的に複合体を形成するため、検出感度を大幅に上昇させることが可能となる。すなわち、本研究の結果より本法は、網羅的タンパク質解析のための超高感度核酸アプタマー検出に応用可能であることが示唆された。

本研究的目的是开发一种新型超灵敏分子探针，能够全面分析细胞内表达的极少量核酸基因和蛋白质的多态性。今年，我们计划研究新型发光核酸探针的合成，目的是制造能够特异性检测膜上亲和素型蛋白的探针。具体而言，我们合成了一种新型化学发光DNA探针，其以大肠杆菌双链DNA为基本骨架，分子内结合有大量异鲁米诺和生物素。结果发现，可以使用市售的异发光试剂和生物素化试剂以非常简单的步骤合成它，并且仅通过乙醇沉淀就可以将其纯化。当研究该DNA探针的化学发光强度时，发现它表现出非常强的发光。此外，考虑到蛋白质芯片的应用，我们评估了DNA探针与吸附在PVDF膜上的亲和素型蛋白质的结合能力，发现DNA探针与亲和素型蛋白质特异性结合，并且DNA探针与PVDF膜上吸附的亲和素型蛋白质结合。证实了通过抗生物素蛋白形成了连接复合物。如果使用该方法的生物素和异鲁米诺标记可以应用于核酸适体，则未与样品蛋白质结合的适体将通过生物素以链式方式形成复合物，从与样品蛋白质结合的适体开始，并进行检测显着提高灵敏度成为可能。换句话说，这项研究的结果表明该方法可以应用于超灵敏核酸适体检测以进行全面的蛋白质分析。