全ゲノム情報に基づいた肺炎クラミジアの病原性遺伝子転写調節の統合的解明

基于全基因组信息综合阐明肺炎衣原体致病基因转录调控

基本信息

批准号：
12206067
负责人：
白井睦訓
金额：
--
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206067/
关键词：
肺炎クラミジア Chlamydia pneumoniae マイクロアレー RT-PCR 転写ゲノム mRNA DNAチップ

项目摘要

肺炎クラミジア日本株J138の全ゲノム塩基配列決定後の作業として、各ORFの抽出とアノテーション、機能予測を行い、そのホームページの作製を完了した(http://w3.grt.kyushu-u.ac.jp/J138/)。各ORFのうち接着・感染に重要な外膜タンパクをコードするomp、pmp遺伝子を含む47の肺炎クラミジア遺伝子と2つの宿主細胞遺伝子を含むDNAマイクロアレイを作製し、肺炎クラミジア感染後6時間ごとに増殖が終息する72時間までHEp-2細胞と非感染の同細胞からから調製した全RNA40ugを鋳型としてアレイした遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写反応を行い、それぞれCy-3、Cy-5でラベルしたcDNAを調製した。得られたcDNAをDNAマイクロアレイにハイブリさせ、各スポットの蛍光をスキャナーで読み込んだ。取り込んだ画像は宿主遺伝子のGAPDHとβアクチンを用いて感染(緑色)または非感染(赤色)細胞のサンプルを標準化した(黄)。その結果、宿主細胞であるヒト細胞に感染した肺炎クラミジアの遺伝子発現を検出することに成功した。非感染細胞ではGAPDHとβアクチン以外は検出しなかったのに対し、感染細胞において特異的に10個のクラミジア遺伝子の発現を認めた。この結果は、作製したクラミジアDNAマイクロアレイの検出特異性が十分高いことを示すものであるが、一方でRT-PCRで検出できたものすべてが検出できたわけではなかったことからRT-PCRより感度が低いことがわかった。今後、肺炎クラミジアの全orfをスポットしたDNAマイクロアレイを作製し、全遺伝子の発現を網羅的に解析する予定であるが、すでに全遺伝子1070個のうち約500遺伝子についてクローン化が完了した。肺炎クラミジアPathogenecity Islandなど多くのユニークな病原遺伝子があることが分かっており、動脈硬化の進展に関与する遺伝子を発見したい。

在确定了日本肺炎衣原体菌株J138的全基因组序列后，我们提取并注释了各个ORF，预测了它们的功能，并完成了网站的创建（http://w3.grt.kyushu-u.ac.jp/J138/ ）。我们创建了一个 DNA 微阵列，其中包含 47 个肺炎衣原体基因和两个宿主细胞基因，包括 omp 和 pmp 基因，它们编码对每个 ORF 之间的粘附和感染很重要的外膜蛋白，并且在肺炎衣原体感染后每 6 小时增殖一次. 结束以HEp-2细胞和未感染细胞制备的40ug总RNA为模板，反应72小时，并使用对阵列基因特异并分别用Cy-3和Cy-5标记的引物进行逆转录反应。准备好了。将获得的cDNA与DNA微阵列杂交，并使用扫描仪读取每个点的荧光。使用宿主基因 GAPDH 和 β-肌动蛋白（黄色）对感染（绿色）或未感染（红色）细胞样本的捕获图像进行标准化。结果，他们成功检测到感染人类宿主细胞的肺炎衣原体的基因表达。虽然在未感染的细胞中没有检测到除 GAPDH 和 β-肌动蛋白以外的基因，但 10 个衣原体基因在感染的细胞中特异性表达。这一结果表明，所制备的衣原体DNA微阵列的检测特异性足够高，但另一方面，并没有检测到所有RT-PCR能够检测到的物质，因此其灵敏度可能不如RT-PCR。结果发现很低。未来，我们计划创建一个DNA微阵列，可以定位肺炎衣原体的所有ORF，并全面分析所有基因的表达，但我们已经完成了1070个基因中约500个的克隆。我们知道有许多独特的致病基因，例如肺炎衣原体的致病岛，我们希望发现与动脉硬化进展有关的基因。