遺伝子のコンディショナルな機能阻害の新手法

一种条件抑制基因功能的新方法

基本信息

批准号：
14011247
负责人：
古田寿昭
金额：
$ 3.65万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011247/
关键词：
ケージド化合物 RNA干渉核酸遺伝子光化学的スイッチ

项目摘要

遺伝子の機能を網羅的に解析するための新手法として、任意の遺伝子の機能を時期および部位特異的に阻害する方法の開発を目指した。網羅的解析における遺伝子の機能阻害法としては、2本鎖RNAを用いるRNAi法と、修飾オリゴヌクレオチドによるアンチセンスオリゴヌクレオチド法が有望である。これらとケージド化合物の化学を組み合わせることで、特定の時期に特定の細胞(組織)で任意の遺伝子の機能を阻害(または破壊)する手法を開発することが可能と考えられる。今年度の主な成果は以下の通りである。1)ケージドsiRNAの合成動物細胞においては、21塩基のsiRNAを導入することでRNAiが観測される。導入されたsiRNAは細胞内で1本鎖に解離してからターゲットに結合すると考えられる。そこで、dsRNAの1本鎖への解離を光制御するために、Bhc基を光解離基として持つ光応答性dsRNA架橋試薬を設計・合成した。この試薬をsiRNAと混合したものをHeLa細胞に導入したところ、GFPに対するRNAi効果が顕著に弱まっていることを観測した。この結果は、合成した光応答性架橋試薬と反応したsiRNAは、RNAi誘導能を失っていること、すなわちケージド化合物になっていることを示唆している。現在、光照射によるRNAi誘導能の回復、リンカー構造の最適化を検討している。2)核酸塩基へのBhc基の導入法の確立様々なアンチセンスオリゴをケージド化合物へと変換するには、核酸塩基部位に光分解性保護基であるBhc基を導入しなければならない。高効率でBhc基を導入できる前駆体であるBhc-クロロホルメートを合成することに成功した。これを用いて合成したケージドアデニンは、従来のものに比べてより優れた光分解効率を示すことも明らかにした。

作为全面分析基因功能的新方法，我们的目标是开发一种以时间和位点特异性方式抑制任何基因功能的方法。作为综合分析中抑制基因功能的方法，使用双链RNA的RNAi方法和使用修饰寡核苷酸的反义寡核苷酸方法是有前途的。通过将这些与笼状化合物的化学相结合，有可能开发出一种在特定时间抑制（或破坏）特定细胞（组织）中任何基因功能的方法。今年的主要工作成果如下。 1) 笼状siRNA的合成在动物细胞中，通过导入21碱基的siRNA来观察RNAi。据认为，引入的 siRNA 在细胞内解离成单链，然后与靶标结合。因此，为了光控制dsRNA解离成单链，我们设计并合成了一种以Bhc基团作为光解离基团的光响应性dsRNA交联试剂。当该试剂与siRNA混合并引入HeLa细胞时，观察到RNAi对GFP的作用显着减弱。该结果表明，与合成的光响应性交联试剂反应的siRNA失去了诱导RNAi的能力，即，变成笼状化合物。我们目前正在研究通过光照射恢复RNAi诱导能力和优化接头结构。 2)建立将Bhc基团引入核碱基的方法为了将各种反义寡核苷酸转化为笼状化合物，需要将Bhc基团(其是可光降解的保护基团)引入核碱基位点。我们成功合成了Bhc-氯甲酸酯，这是一种可以高效引入Bhc基团的前体。研究还表明，与传统产品相比，使用该产品合成的笼状腺嘌呤具有优异的光降解效率。