siRNAの機能制御によるコンディショナル RNAi

通过控制 siRNA 的功能进行条件 RNAi

基本信息

批准号：
16011255
负责人：
古田寿昭
金额：
$ 2.94万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16011255/
关键词：
RNAi ケージド化合物遺伝子発現光制御哺乳動物細胞

项目摘要

RNA interference (RNAi、RNA干渉)は、21-23塩基の短い2本鎖RNA、small interfering RNAs (siRNA)、を介して起こる、配列特異的遺伝子発現サイレンシングの強力な手法である。本研究では、ケージド化合物の化学とRNAiを組み合わせて、光照射によって標的遺伝子の発現をコンディショナルに抑制する手法の開発を目指した。RNAiを光制御する方法として、siRNAの1本鎖への解離を光制御することを考え、3種類の光解離性クロスリンカー(1-3)を合成した。合成した光解離性クロスリンカーと混合することでsiRNAがクロスリンクされ、一本鎖への解離が阻害されること、および光照射によって再び元のsiRNAが生成することを電気泳動等により確認した。続いて、HeLa細胞に一過的に発現したGFPの蛍光強度を指標にして、GFPを標的にしたsiRNAによるRNAiの効果を定量した。その結果、siRNA (GFP)を加えた細胞ではGFPの発現が約90%抑制されたのに対し、Cross-linker 3(3)と反応させたsiRNAを細胞に導入した場合はRNAi誘導能が20%程度に低下すること、また、導入後の細胞にUV光を照射することにより、GFPの発現を効果的に抑制することを確認した。さらに、内因性遺伝子であるLamin B1をターゲットとするsiRNAのクロスリンクにも成功し、合成したケージドsiRNA (lamin B1)を導入した細胞にUV光を照射することによりsiRNAがほぼ完全にもとの機能を取り戻し、細胞内のLamin B1の発現が完全に抑制されていることを、ウェスタンブロットにより確認した。

RNA干扰（RNAi）是一种针对序列特异性基因表达沉默的强大技术，它通过21-23个基碱基短双链RNA，小干扰RNA（siRNA）发生。在这项研究中，我们旨在开发一种将笼中化合物与RNAi的化学结合的方法，以通过光照射有条件地抑制靶基因的表达。考虑了将siRNA分解为单链，作为光控制RNAi的方法，将三种类型的光解散交叉接头（1-3）合成。通过电泳或类似的siRNA证实，通过与合成的光解散交叉链链键混合，将siRNA交联，从而抑制分离为单个链，而原始siRNA再次通过光照射产生。接下来，使用在HELA细胞中瞬时表达的GFP的荧光强度对靶向GFP的RNAi的效果进行了定量。结果，已经证实，在siRNA（GFP）的细胞中，大约90％的GFP表达被抑制，而当将siRNA与交联3（3）引入细胞中时，RNAi诱导能力降低到约20％，并在与UV光有效抑制GFP表达后的细胞辐射中降低。此外，我们成功地交联了针对内源基因lamin b1的siRNA，并通过将紫外线照射到与合成的笼中的笼siRNA（lamin b1）引入的细胞中，几乎完全恢复了siRNA的功能，并通过蛋白质印刷中的lamin b1表达被抑制了lamin b1。