siRNAの機能制御によるコンディショナル RNAi

通过控制 siRNA 的功能进行条件 RNAi

基本信息

批准号：
16011255
负责人：
古田寿昭
金额：
$ 2.94万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16011255/
关键词：
RNAi ケージド化合物遺伝子発現光制御哺乳動物細胞

项目摘要

RNA interference (RNAi、RNA干渉)は、21-23塩基の短い2本鎖RNA、small interfering RNAs (siRNA)、を介して起こる、配列特異的遺伝子発現サイレンシングの強力な手法である。本研究では、ケージド化合物の化学とRNAiを組み合わせて、光照射によって標的遺伝子の発現をコンディショナルに抑制する手法の開発を目指した。RNAiを光制御する方法として、siRNAの1本鎖への解離を光制御することを考え、3種類の光解離性クロスリンカー(1-3)を合成した。合成した光解離性クロスリンカーと混合することでsiRNAがクロスリンクされ、一本鎖への解離が阻害されること、および光照射によって再び元のsiRNAが生成することを電気泳動等により確認した。続いて、HeLa細胞に一過的に発現したGFPの蛍光強度を指標にして、GFPを標的にしたsiRNAによるRNAiの効果を定量した。その結果、siRNA (GFP)を加えた細胞ではGFPの発現が約90%抑制されたのに対し、Cross-linker 3(3)と反応させたsiRNAを細胞に導入した場合はRNAi誘導能が20%程度に低下すること、また、導入後の細胞にUV光を照射することにより、GFPの発現を効果的に抑制することを確認した。さらに、内因性遺伝子であるLamin B1をターゲットとするsiRNAのクロスリンクにも成功し、合成したケージドsiRNA (lamin B1)を導入した細胞にUV光を照射することによりsiRNAがほぼ完全にもとの機能を取り戻し、細胞内のLamin B1の発現が完全に抑制されていることを、ウェスタンブロットにより確認した。

RNA 干扰 (RNAi) 是一种强大的序列特异性基因表达沉默方法，通过 21-23 个碱基的短双链 RNA、小干扰 RNA (siRNA) 进行。在本研究中，我们旨在结合笼式化合物化学和RNAi，开发一种通过光照射条件性抑制靶基因表达的方法。作为光控制 RNAi 的方法，我们考虑光控制 siRNA 解离成单链，并合成了三种类型的光不稳定交联剂 (1-3)。通过电泳等证实，通过与合成的可光裂解交联剂混合，抑制其解离成单链，使siRNA交联，并且通过光照射再生原始siRNA。接下来，以HeLa细胞中瞬时表达的GFP的荧光强度为指标，对使用靶向GFP的siRNA的RNAi的效果进行定量。结果，在添加了siRNA(GFP)的细胞中，GFP表达被抑制约90%，而当将与交联剂3(3)反应的siRNA导入细胞时，RNAi诱导能力降低了20%证实用UV光照射转染细胞可有效抑制GFP的表达。此外，我们成功地交联了靶向内源基因Lamin B1的siRNA，并且通过用紫外线照射导入了合成的笼状siRNA（核纤层蛋白B1）的细胞，通过Western blotting证实了siRNA几乎完全恢复。功能恢复，细胞内Lamin B1表达完全被抑制。