生体分子のパスウェイ・ネットワークの光制御法の確立

生物分子通路网络光控方法的建立

基本信息

批准号：
17017036
负责人：
古田寿昭
金额：
$ 2.88万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞現象を担う個々の分子の機能は明らかになりつつあるが,既存の研究手法の組み合わせだけでは,生命の全体像を捉えることは難しい。生命をシステムとして理解することを可能にする新しい方法論の開発が急務である。例えば,複数の分子が協同してはたらくネットワークを分解して,再構成して理解する学際的な研究手法が必要である。これを可能にする要素技術を確立するため,ケージド化合物の化学を活用して,時期および細胞(組織)特異的に細胞現象を制御する技術の開発を目指して研究を行った。ペプチド核酸(PNA)は,DNAの糖-リン酸骨格を(2-アミノエチル)グリシンに置換した核酸類似体である。PNAは,DNAやRNAとの相補鎖形成において高い親和性と特異性を持ち,アンチセンス試薬として適している。また,細胞核内に侵入してターゲットのdsDNAと結合し,転写を抑制することも報告されている。そこで,生きた細胞内で遺伝子発現を光制御することを目指し,PNAの核酸塩基部分に光分解性保護基を導入したcaged PNAを合成し,そのアンチセンス効果を光制御する可能性を検討した。まず,光分解性保護基であるBmcmoc基をシトシンに導入してケージドPNAモノマー(C^<Bmcmoc>)とし,16-merのcaged PNA(H_2N-TTCTCTTC^<Bmcmoc>CTTCTCT-Gly-COOH)を合成した。合成したcaged PNAとDNAとの親和性を,3本鎖形成に伴うゲルシフトとTm値の測定で評価した。その結果,1個のBmcmoc基の導入でTm値は10℃低下し,3本鎖形成も阻害されることがわかった。また,PNAによるPCR clampingもBmcmoc基の導入によって阻害され,caged PNAが存在してもテンプレートDNAの増幅はほとんど影響されなかった。

尽管负责细胞现象的单个分子的功能越来越清晰，但仅通过简单地结合现有的研究方法很难掌握生命的整体图景。迫切需要开发新的方法，使我们能够理解生命作为一个系统。例如，需要跨学科的研究方法来分解和重建多个分子共同作用的网络来理解它们。为了建立使这成为可能的基本技术，我们进行了旨在开发利用笼状化合物的化学作用以特定时期和细胞（组织）特定方式控制细胞现象的技术的研究。肽核酸 (PNA) 是一种核酸类似物，其中 DNA 的糖磷酸主链被 (2-氨乙基) 甘氨酸取代。 PNA与DNA和RNA形成互补链具有高亲和力和特异性，适合作为反义试剂。据报道，它进入细胞核并与靶双链 DNA 结合，抑制转录。因此，为了光控制活细胞中的基因表达，我们合成了在PNA核碱基部分引入可光降解保护基团的笼状PNA，并研究了光控制其反义效应的可能性。首先，将可光降解的保护基 Bmcmoc 基团引入胞嘧啶中，形成笼状 PNA 单体 (C^<Bmcmoc>) 和 16 聚体笼状 PNA (H_2N-TTCTCTTC^<Bmcmoc>CTTCTCT-Gly- COOH）被合成。通过测量与三链形成相关的凝胶位移和 Tm 值来评估合成的笼状 PNA 与 DNA 的亲和力。结果表明，引入1个Bmcmoc基团可使Tm值降低10℃，并抑制三链形成。 Bmcmoc 基团的引入也抑制了 PNA 的 PCR 钳制，并且模板 DNA 扩增几乎不受笼状 PNA 的存在的影响。