水チャネルの選択性とその制御機構の解明

水通道选择性及其控制机制的阐明

基本信息

批准号：
13137205
负责人：
光岡薫
金额：
$ 33.92万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (2004)Kyoto University (2001-2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度、AQP4の二次元結晶二枚が細胞外ループで相互作用してできた特殊な二次元結晶について、電子回折図形と電子顕微鏡像を同じ結晶から続いて撮影して、それを基に電子線結晶構造解析を行う手法を開発した。これについては今年度論文発表を行った。また、この構造解析法を用いて、AQP4の原子モデルを3.2Å分解能で決定し、そこから、生体中で観察できるAQP4の脂質二重層内での格子形成のメカニズムを明らかにした。この相互作用にはアルギニンとチロシンの側鎖同士の水素結合が関与しており、この相互作用はN末付近にあるアルギニンにより阻害されると考えられる。実際、天然には23番目のメチオニンよりN末側がないサブタイプがあることが知られており、このタイプのAQP4を発現すると、大きな格子を形成することが知られている。これにより、二つのサブタイプを共存されることにより、天然に局在しているAQP4の格子の大きさがコントロールされているという機構が明らかになった。また、結晶中での細胞外のループ同士の相互作用が明らかになったので、その天然での役割についても研究を継続している。AQP0については細胞外同士の相互作用が細胞接着に利用されているという知見が得られており、このような性質が水チャネル、アクアポーリンのもう一つの機能として広く利用されている可能性もある。これ以外にAQP1の分子動力学シミュレーションから、水の効率的な透過に重要と考えられる残基がいくつか特定できたので、それらの部位の変異体を、昆虫由来のSf9細胞とバキュロウイルスを用いて発現する系を確立した。今後、この発現した蛋白質を用いて機能測定を行い、効率的な水透過の詳細な分子機構を明らかにしたいと思う。最後にAQP3に関しは、Sf9細胞を用いて1L培養液から数mgの蛋白質を定常的に得られるようになったので、電子線結晶構造解析の進展が期待される。

去年，我们开发了一种使用电子衍射模式和电子显微镜图像分析电子束晶体结构的方法，该图像是通过与两个AQP4二维晶体相互作用的特殊二维晶体的图像。今年的论文发表了。使用这种结构分析方法，以3.2Å分辨率确定了AQP4的原子模型，从中，可以在活生物体中观察到AQP4脂质双层中晶格形成的机理。这种相互作用涉及精氨酸和酪氨酸的侧链之间的氢键，并且认为这种相互作用被位于N末端附近的精氨酸抑制。实际上，众所周知，有一种自然不是N末端的亚型，而不是第23甲硫氨酸，并且在表达这种类型的AQP4时，已知它会形成一个大的晶格。这揭示了一种机制，即自然局部AQP4晶格的大小通过共存两个亚型来控制。此外，由于已经揭示了晶体中细胞外回路之间的相互作用，因此研究也继续在其自然作用上发挥作用。关于AQP0，已经发现细胞外相互作用用于细胞粘附，并且该特性可能被广泛用作水通道Aquaporin的另一个功能。除此之外，我们还确定了几个残基，这些残基被认为对AQP1的分子动力学模拟有效渗透至关重要，并且我们建立了一个系统，其中使用昆虫衍生的SF9细胞和杆状病毒表达这些位点的突变体。将来，我们希望使用这种表达的蛋白质进行功能测量，以阐明有效的水渗透的详细分子机制。最后，关于AQP3，可以使用SF9细胞从1L培养基中不断获得几毫克的蛋白质，并且可以预期会发生电子束晶体结构分析的进步。