内分泌攪乱物質が魚類の生殖に及ぼす影響の機構解析

内分泌干扰物对鱼类繁殖影响的机理分析

基本信息

批准号：
13027202
负责人：
原彰彦
金额：
$ 9.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

魚類を用いた環境エストロジェンの影響評価のバイオマーカーとしてビテロジェニン(Vg)に加えて卵膜蛋白前駆物質、コリオジェニン(Chg)が注目されている。今回、ChgとZona Pellucida Protein (ZP)の遺伝子レベルでの比較検討をするとともにサケ科魚類Chgの化学発光免疫測定法(CLIA法)を確立した。さらにエストロジェンによるin vitro及びin vivo系における動態をVgと併せて観察し、回遊中のサケ科魚類雄血中のChgの測定を行った。Chg Hをコードする2種類のクローン(Chg Hα、Chg Hβ)およびChg Lをコードするクローンの全塩基配列を明らかにした。またRT-PCRにより、Chg遺伝子は肝臓でのみ発現していた。一方、卵巣からZPB及びZPCと思われる遺伝子を単離し、それらの発現は卵巣にのみ観察された。Chg H測定系は、0.12-125ng/ml、Chg Lは、0.24-250ng/mlでスタンダードカーブが得られ、高感度定量ができた。ニジマス雄の肝細胞培養系にE2を添加した結果、ChgはVg同様、2日目に培養液中に誘導された。Chg HはE2添加後2日目でVgと比べ、より低濃度のE2による誘導を確認した。サケ科魚種ChgはWestern blotの結果、既報のサクラマスChg(Chg H:48k,Chg L:43k)と分子量が近似する一本のバンドが見られた。CLIAのサクラマス標準血清を用いたスタンダードカーブと各魚種血清の希釈系列は、ベニザケ血清のChg Lを除いて平行性を示した。北洋域のサケ科魚類雄血清中のVg並びにChgを測定した結果、各魚種でそれぞれ検出され、シロザケとスチールヘッドからは、これまで養殖魚で検討してきたベースライン(10μg/ml)を越える個体も観察された。

除了卵黄蛋白原 (Vg) 之外，卵膜蛋白前体 coryogenin (Chg) 作为评估环境雌激素对鱼类影响的生物标志物也引起了人们的关注。在本研究中，我们在基因水平上比较了Chg和透明带蛋白（ZP），并建立了鲑鱼Chg的化学发光免疫分析（CLIA）方法。此外，我们还观察了体内和体外系统中雌激素与Vg的动态，并测量了洄游的雄性鲑鱼血液中的Chg。确定了编码 Chg H 的两个克隆（Chg Hα 和 Chg Hβ）和编码 Chg L 的克隆的完整核苷酸序列。此外，RT-PCR显示Chg基因仅在肝脏中表达。另一方面，从卵巢中分离出被认为是ZPB和ZPC的基因，并且仅在卵巢中观察到它们的表达。 Chg H 测量系统在 0.12-125ng/ml 下获得标准曲线，Chg L 在 0.24-250ng/ml 下获得标准曲线，从而实现高灵敏度定量。在雄性虹鳟鱼的肝细胞培养体系中添加E2后，第二天培养基中就诱导出Chg，与Vg类似。添加E2两天后，用比Vg浓度低的E2诱导Chg H。鲑科鱼类 Chg 的蛋白质印迹分析显示一条单条带，其分子量与之前报道的樱桃鲑鱼 Chg 相似（Chg H：48k，Chg L：43k）。使用 CLIA 樱桃鲑鱼标准血清和各鱼类血清稀释系列的标准曲线显示出平行性，但红鲑血清 Chg L 除外。对北大洋地区雄性鲑鱼血清中的 Vg 和 Chg 进行测量的结果是，在每种鱼类中均检测到了 Vg 和 Chg，其中在大马哈鱼和虹鳟中，它们超过了已检测的基线（10 μg/ml）。迄今为止还观察到了养殖鱼。