内分泌攪乱物質が魚類の生殖に及ぼす影響の機構解析

内分泌干扰物对鱼类繁殖影响的机理分析

基本信息

批准号：
13027202
负责人：
原彰彦
金额：
$ 9.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

魚類を用いた環境エストロジェンの影響評価のバイオマーカーとしてビテロジェニン(Vg)に加えて卵膜蛋白前駆物質、コリオジェニン(Chg)が注目されている。今回、ChgとZona Pellucida Protein (ZP)の遺伝子レベルでの比較検討をするとともにサケ科魚類Chgの化学発光免疫測定法(CLIA法)を確立した。さらにエストロジェンによるin vitro及びin vivo系における動態をVgと併せて観察し、回遊中のサケ科魚類雄血中のChgの測定を行った。Chg Hをコードする2種類のクローン(Chg Hα、Chg Hβ)およびChg Lをコードするクローンの全塩基配列を明らかにした。またRT-PCRにより、Chg遺伝子は肝臓でのみ発現していた。一方、卵巣からZPB及びZPCと思われる遺伝子を単離し、それらの発現は卵巣にのみ観察された。Chg H測定系は、0.12-125ng/ml、Chg Lは、0.24-250ng/mlでスタンダードカーブが得られ、高感度定量ができた。ニジマス雄の肝細胞培養系にE2を添加した結果、ChgはVg同様、2日目に培養液中に誘導された。Chg HはE2添加後2日目でVgと比べ、より低濃度のE2による誘導を確認した。サケ科魚種ChgはWestern blotの結果、既報のサクラマスChg(Chg H:48k,Chg L:43k)と分子量が近似する一本のバンドが見られた。CLIAのサクラマス標準血清を用いたスタンダードカーブと各魚種血清の希釈系列は、ベニザケ血清のChg Lを除いて平行性を示した。北洋域のサケ科魚類雄血清中のVg並びにChgを測定した結果、各魚種でそれぞれ検出され、シロザケとスチールヘッドからは、これまで養殖魚で検討してきたベースライン(10μg/ml)を越える個体も観察された。

除耐生蛋白（VG）外，鸡蛋膜蛋白前体Coriogenin（CHG）吸引了人们的注意，作为评估使用鱼类环境雌激素的影响的生物标志物。在这里，我们比较并建立了一种在基因水平的CHG和Zona pelucida蛋白（ZP）的化学发光免疫测定法（CLIA）方法，并建立了用于CHG的化学发光免疫测定法（CLIA方法），用于CHG，Salmonidae Fish。此外，在迁移过程中观察到雌激素的体外和体内系统中的动力学，并在迁移过程中雄性血液中的CHG。揭示了两个CHG H编码克隆（CHGHα，CHGHβ）和CHG L编码克隆的整个碱基序列。此外，RT-PCR显示CHG基因仅在肝脏中表达。另一方面，从卵巢中分离出据信为ZPB和ZPC的基因，仅在卵巢中观察到它们的表达。 CHG H测量系统为0.12-125ng/ml，CHG L为0.24-250ng/ml，可以进行高灵敏度测定。由于将E2添加到雄性彩虹鳟鱼的肝细胞培养系统中，CHG在第二天在培养基中被诱导，就像VG一样。与E2添加后的第二天相比，与VG相比，证实了E2在较低浓度下通过E2诱导CHG H的诱导。由于蛋白质印迹，CHG沙门氏科的物种显示出近似于先前报道的樱桃鲑鱼鲑鱼CHG的分子量（CHG H：48K，CHG L：43K）的分子量。使用Clia Cherry Salmon标准血清的标准曲线和每种鱼类的稀释系列均表现出平行性，除了Sockeye鲑鱼血清的Chg L。由于在北海的鲑鱼科鱼类的雄性血清中测量了VG和CHG，在每个物种中都检测到VG和CHG，并且从白色的鲑鱼和钢头中观察到了直到现在在养殖鱼类中研究的基线（10μg/ml）的个体（10μg/ml）。