魚類ビテロゲニンの卵黄蛋白への分子解裂に関わる酵素の検索

寻找参与鱼卵黄蛋白分子裂解为蛋黄蛋白的酶

基本信息

批准号：
08660243
负责人：
原彰彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ビテロゲニン分解酵素の検出法の確立:卵黄形成期のアメマスを用い,ビテロゲニン分解酵素の検出法を確立した。精製ビテロゲニンをビオチン標識し,卵水溶性画分(WSF)を加えた後,37℃,pH5.2で16時間インキュベートした。分解産物をゲル濾過およびSDS-PAGEに供し,ペルオキシターゼ標識アジビン,または抗リポビテリン血清および抗β′-コンポーネント血清によるWestern blottingを行った。その結果,精製ビテロゲニンは卵黄蛋白であるリポビテリンおよびβ′-コンポーネントのサブユニットと分子量および抗原性を同じくするポリペプタイドに分解された。2.卵抽出液の分画および分解酵素の性状解析:卵黄形成途上のサクラマス卵を材料とし,卵抽出液を水沈殿法および硫安塩析,さらにDE-52,ハイドロキシルアパタイト,フェニルスーパーロース,モノQ,スーパーロース12によるカラムクロマトグラフィーに順次供し,精製ビテロゲニン分解酵素を得た。各分画のビテロゲニン分解酵素の検索は上述のSDS-PAGEによる検出法を用いて行った。精製酵素をSDS-PAGEに供した結果,42kDaの位置に一本のバンドが観察され,このバンドは抗ヒトカテプシンDに反応した。さらにWSFに蛋白分解酵素阻害剤を添加し,ビテロゲニン分解活性に対する阻害性を観察した結果,この活性はペプスタチンAによってのみ特異的に阻害された。以上のことより,サケ科魚類の卵黄形成期の卵中にはカテプシンD様酵素が存在し,ビテロゲニンの分子解裂に関与することが強く示唆された。

1.卵黄蛋白原降解酶的检测方法的建立：建立了在卵黄发生阶段使用Amemasu检测卵黄蛋白原降解酶的方法。纯化的卵黄原蛋白用生物素标记，添加卵可溶性组分 (WSF)，并在 37°C、pH 5.2 下孵育 16 小时。将降解产物进行凝胶过滤和SDS-PAGE，并用过氧化物酶标记的抗卵黄蛋白或抗卵黄蛋白血清和抗β'-成分血清进行Western blotting。结果，纯化的卵黄蛋白原被降解为与蛋黄蛋白脂卵黄蛋白和β'-组分的亚基具有相同分子量和抗原性的多肽。 2、鸡蛋提取物的分级及降解酶性质分析：采用卵黄形成过程中的樱桃鲑鱼卵，将鸡蛋提取物进行水沉和硫酸铵盐析，并进一步用DE-52、羟基磷灰石、苯基超洛糖、纯化卵黄蛋白原进行处理使用 MonoQ 和 Superose 12 通过连续柱色谱法获得降解酶。使用上述SDS-PAGE检测方法寻找各级分中的卵黄蛋白原降解酶。当纯化的酶进行SDS-PAGE时，在42kDa位置观察到单条带，该条带与抗人组织蛋白酶D发生反应。此外，我们在WSF中添加了蛋白酶抑制剂，观察其对卵黄蛋白原降解活性的抑制作用，结果发现该活性仅被胃酶抑素A特异性抑制。这些结果强烈表明组织蛋白酶 D 样酶存在于卵黄发生过程中的鲑鱼卵中，并参与卵黄蛋白原的分子裂解。