魚類ビテロゲニンの合成及び取り込み気候に関する免疫生化学的研究

鱼类卵黄蛋白原合成及摄取环境的免疫生化研究

基本信息

批准号：
09460092
负责人：
原彰彦
金额：
$ 5.5万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞培養系を用いたVg合成:ウナギ肝の初代培養系を用いてVg合成能の挙動を調べた結果,雄肝細胞ではE2に対するVg合成は見られず,雌肝では顕著なVg合成が確認された。E2とサケ下垂体,また成長ホルモン及びプロラクチンの添加も,E2の単独添加に比べ効果的であった。卵母細胞の生体外卵黄形成:ウナギ卵母細胞の生体外培養系を用いて,卵黄形成を進行させ,Vgの取り込み制御因子に関して解析を行った。培養系にサケ下垂体糖蛋白画分(SPG)を添加した結果,培養開始から短時間でVgの取り込みが開始され,未発達の卵母細胞にも卵黄形成が誘導された。海産魚Vgの成熱に伴う変動:カンパチ,キジハタ及びトラフグの雌またE2処理魚血清からVgを精製し,測定法を確立した。カンパチ血清及び体表粘液中のVgの周年変化を測定した結果から卵黄形成期を特定した。Vgの卵黄蛋白への分解過程及び胚発生に伴う卵黄蛋白の分解過程:(1)サクラマス卵巣からVg分解酵素の精製を行い,42kDaの蛋白を得た。この蛋白質は抗ヒトカテプシンD血清に反応した。(2)サケマス卵を用いて,発生に伴う卵黄蛋白の変化をSDS―PAGEにより観察した結果,発眼期以降にリボビテリン(Lv)H鎖の染色性の減少に伴い,新たに低分子の蛋白バンドが出現した。孵化以降これらのバンドは染色性を増し,浮上期以降にはH鎖は消失した。(3)Lv分解酵素を検索し,Pefabloc SCにより阻害されたことから,先の結果と併せVgの分子解裂にはカテプシンD様のアスパラギン酸プロテアーゼ,Lvの分解にはトリプシンまたはキモトリプシン様セリンプロテアーゼが関与することが示唆された。卵黄蛋白のポリペプタイドへの分解過程:マツカワの卵より2種のLvを精製し特異抗体を作製した。血清中に2種類のVgの存在が明らかとなり,Vgは卵に取り込まれると2種のLvと2種のβ'-component及びホスビチンに解裂されると推察され,その後最終成熟期を経ると1種のLvは部分分解し,他の卵黄蛋白はアミノ酸まで分解されることが示唆された。

使用细胞培养系统的Vg合成：使用鳗鱼肝脏的原代培养系统研究Vg合成能力的行为的结果是，在雄性肝细胞中没有观察到针对E2的Vg合成，并且在雌性肝脏中确认了显着的Vg合成。完成了。添加E2和鲑鱼垂体，以及生长激素和催乳素，比单独添加E2更有效。卵母细胞体外卵黄发生：利用鳗鱼卵母细胞体外培养系统，进行卵母细胞卵黄发生进展并分析调节Vg摄取的因素。通过在培养体系中添加鲑鱼垂体糖蛋白组分（SPG），培养开始后短时间内即可开始摄取Vg，即使在未成熟卵母细胞中也能诱导卵黄发生。与发情成熟相关的海鱼Vg的波动：从雌性鰤鱼、黄尾石斑鱼、虎河豚和E2处理鱼的血清中纯化Vg，并建立测量方法。通过测量鰤鱼血清和体表粘液中Vg的每年变化的结果来确定卵黄发生期。 Vg分解为蛋黄蛋白的过程以及伴随胚胎发育的蛋黄蛋白的分解过程：(1)从樱桃鲑鱼卵巢中纯化Vg降解酶，得到42kDa的蛋白。该蛋白质与抗人组织蛋白酶 D 血清发生反应。 (2)利用SDS-PAGE观察鲑鱼鳟鱼卵发育过程中蛋黄蛋白的变化，发现在眼期后，核卵黄素(Ribovitellin，Lv)H链的染色减少，并形成新的低分子蛋白A。乐队出现了。孵化后，这些条带的可染色性增加，并且H链在漂浮阶段后消失。 (3)我们搜索了Lv降解酶，发现它们被Pefabloc SC抑制，结合之前的结果发现，组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶负责Vg的分子裂解，而胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶负责 Lv 的分解。蛋黄蛋白分解成多肽的过程：从松川蛋中纯化出两种类型的Lv，并产生特异性抗体。血清中存在两种类型的Vg已被揭示，推测当Vg被摄入鸡蛋时，它被裂解成两种类型的Lv、两种类型的β'-成分和卵黄高磷蛋白，然后通过后表明在最后的成熟阶段，一种类型的Lv被部分降解，而其他蛋黄蛋白被降解为氨基酸。