受精機構におけるユビキチン-プロテアソームシステム

受精机制中的泛素-蛋白酶体系统

基本信息

批准号：
12146201
负责人：
横沢英良
金额：
$ 31.68万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

1.マボヤ卵黄膜蛋白質VC70のユビキチンリガーゼの探索:すでに、マボヤ精子放出液からVC70蛋白質をユビキチン化する分子量700kDaのユビキチン化酵素を単離し、さらに、そのユビキチン化活性を促進するユビキチンリガーゼE3様酵素を、ユビキチン化サイトLys234を含むVC70ペプチドを固定化したカラムを用いたクロマトグラフィーにより単離した。しかし、得られた蛋白質量が微量のために生化学的解析が不可能であったので、上記のVC70ペプチドをベイトに用いて酵母two-hybridスクリーニングを行い、2つのVC70ペプチド結合蛋白質を得た。一つは、UBAドメイン含有蛋白質で、これはVC70蛋白質が酵母内でユビキチン化され、そのポリユビキチン鎖を介して結合蛋白質として得られたと考えられる。一方、マボヤの近縁種であるカタユウレイボヤのESTデータベース検索の結果、もうひとつのクローンは全長ではなく、N末端配列を欠失したものであると推測される。この全長をクローニングし、VC70蛋白質のE3酵素である可能性や受精における役割を明らかにすることが今後の課題である。2.胚特異的ユビキチンレセプターの機能解析:アフリカツメガエルの胚特異的ユビキチンレセプターRpn10cが抗アポトーシス因子Scytheと特異的に結合する。Rpn10cとの結合に関与するScytheのN末端領域を解析し、それがタンデムに連結した4つのユビキチン様ドメインからなり、少なくとも2つのドメインの存在がRpn10cとの結合に必要であることを明らかにした。また、そのドメインがアポトーシス制御に必要であることを明らかにした。Rpn10cを含む胚特異的プロテアソームがScytheを介してどのように発生過程におけるアポトーシスを制御しているかを明らかにすることが今後の課題である。

1.寻找Maboya卵黄膜蛋白VC70的泛素连接酶：我们已经从Maboya精子释放液中分离到了分子量为700 kDa的泛素化VC70蛋白，并且，使用固定有含有泛素化位点 Lys234 的 VC70 肽的柱，通过色谱法分离促进泛素化活性的泛素连接酶 E3 样酶。然而，由于获得的蛋白质含量极少，无法进行生化分析，因此我们以上述VC70肽为诱饵进行酵母双杂交筛选，获得了两种VC70肽结合蛋白。一种是含有 UBA 结构域的蛋白质，它被认为是通过泛素化酵母中的 VC70 蛋白质并通过其多聚泛素链获得的结合蛋白。另一方面，作为Maboya的近亲Ciona的EST数据库的检索结果，推测另一个克隆不是全长的，而是缺少N末端序列。未来的任务将是克隆该全长蛋白，并阐明 VC70 蛋白是 E3 酶的可能性及其在受精中的作用。 2.胚胎特异性泛素受体的功能分析：非洲爪蟾胚胎特异性泛素受体Rpn10c与抗凋亡因子Scythe特异性结合。我们分析了与 Rpn10c 结合有关的 Scythe N 端区域，发现它由四个串联的泛素样结构域组成，并且至少有两个结构域的存在是与 Rpn10c 结合所必需的。我们还发现该结构域是细胞凋亡调节所必需的。我们未来的挑战是阐明胚胎特异性蛋白酶体（包括 Rpn10c）如何通过 Scythe 控制发育过程中的细胞凋亡。