ユビキチン化修飾を司る癌関運遺伝子の探索

寻找控制泛素化修饰的癌症相关基因

基本信息

批准号：
14657575
负责人：
横沢英良
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.癌関連因子である細胞増殖抑制因子Tob/BTGファミリーがユビキチン化を受けて分解されることをすでに明らかにしている。そこで、そのユビキチン化修飾機構を明らかにするために、Tob/BTGファミリーに結合する蛋白質を酵母Two-hybridスクリーニングにより探索したが、期待する結果が得られなかった。2.細胞周期制御に関わる蛋白質のユビキチン依存的分解を司るユビキチンリガーゼE3として、G1/S期で機能するSCF複合体とG2/M期で機能するAPC/Cが存在する。Tob/BTGファミリーはS期進行を抑制することから、そのユビキチン化にSCF複合体が関与する可能性が考えられる。そこで、BTG1あるいはBTG2を、SCF複合体の構成サブユニットであるCul1(足場蛋白質)、Skp1(アダプター蛋白質)とともに、HeLa細胞に強制発現させ、免疫沈降とウエスタンブロッティングを行った。その結果、Cul1、Skp1のいずれもが、BTG1およびBTG2と共沈降することが明らかになった。3.次に、SCF複合体の基質認識サブユニットであるF-box蛋白質を各種用いて、BTG1あるいはBTG2との免疫沈降実験を行った。その結果、BTG1およびBTG2のいずれもが、2つのF-box蛋白質、Fwd1およびSkp2と結合することが明らかになった。4.そこで、2つのF-boxタンパク質の強制発現条件下で、BTG1のユビキチン化を解析したところ、Fwd1がBTG1のユビキチン化を顕著に促進し、Skp2は弱い促進効果しか示さなかった。以上の結果から、BTG1のユビキチン化はSCF^<Fwd1>複合体によって行われることが明らかになった。今後、BTGタンパク質のユビキチン化修飾の制御機構を解明することが必要である。

1. 已经发现，作为癌症相关因子的Tob/BTG细胞生长抑制剂家族会发生泛素化并被降解。因此，为了阐明泛素化修饰机制，我们通过酵母双杂交筛选寻找与Tob/BTG家族结合的蛋白，但没有得到预期的结果。 2.作为控制参与细胞周期控制的蛋白质的泛素依赖性降解的泛素连接酶E3，有在G1/S期发挥作用的SCF复合体和在G2/M期发挥作用的APC/C。由于 Tob/BTG 家族抑制 S 期进展，因此 SCF 复合物可能参与其泛素化。因此，我们在HeLa细胞中强制表达BTG1或BTG2以及作为SCF复合物的组成亚基的Cul1（支架蛋白）和Skp1（适配器蛋白），并进行免疫沉淀和蛋白质印迹。结果表明，Cul1和Skp1均与BTG1和BTG2共同沉积。 3.接下来，我们使用各种F-box蛋白（SCF复合物的底物识别亚基）对BTG1或BTG2进行了免疫沉淀实验。结果显示，BTG1 和 BTG2 均与两种 F-box 蛋白 Fwd1 和 Skp2 结合。 4.当我们分析两种F-box蛋白强制表达条件下BTG1的泛素化情况时，我们发现Fwd1显着促进BTG1的泛素化，而Skp2仅表现出微弱的促进作用。这些结果表明BTG1泛素化是由SCF^<Fwd1>复合物进行的。未来有必要阐明BTG蛋白泛素化修饰的控制机制。