ゲノム防御機構とがん抑制蛋白p53

基因组防御机制和抑癌蛋白p53

基本信息

批准号：
12143205
负责人：
山泉克
金额：
$ 23.81万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12143205/
关键词：
複製後修復 Rad18 Rad6 ユビキチン化細胞内局在 TLS polη PCNA ゲノム不安定性発現調節 UV^SS TCR ゲノム不安定化 p53 MAPキナーゼ p38 ES細胞ノックアウトマウス

项目摘要

紫外線により誘導されるピリミジン2量体は他の損傷と比較して修復効率が悪く、DNA複製の進行を阻害することが多い。Rad18はRad6と共同して停止部位でのPCNAをモノユビキチン化することで、損傷乗り越え合成に関与するポリメラーゼηの誘導に関与することを示した。Rad18蛋白質はSDS-PAGEにおいて2本のバンドとして検出される。このうち85kdに相当する分子種は75kdに相当するもう1本の分子種がモノユビキチン化したものであることを質量分析により明らかにした。Rad18のモノユビキチン化機構を解明するため、分子内のRINGフィンガー領域(RFD)及びZnフィンガー領域(ZFD)に点突然変異を導入し、これらの変異Rad18蛋白質のモノユビキチン化を野生型と比較検討した。野生型Rad18蛋白はRad6蛋白の発現量に依存してモノユビキチン化が促進されるのに対してZFD変異型ではモノユビキ・チン化がほとんど見られなくなること、RFD変異型は速やかに分解され、発現量が著しく減少することがわかった。また、Rad6結合部位(R6BD)を欠損したRad18は野生型細胞中ではモノユビキチン化されるのに対し、Rad18^<-/->マウス細胞中ではモノユビキチン化されない。一方、ZFD変異型Rad18は両細胞中でもモノユビキチン化されないことが明らかとなった。更に酵母でのTwo-hybrid法の解析からRad18蛋白はZFDで2量体を形成することも明らかとなった。これらの実験結果より以下のモデルを提唱した。Rad18はR6BDを介してRad6と結合する一方、ZFDを介して2量体を形成する。2量体中の一方のRad18はRad6と結合したもう一方のRad18によりモノユビキチン化される。更にこれら2種類のRad18蛋白質の細胞内局在を免疫染色法や生化学的方法を用いて解析した結果、モノユビキチン化されたRad18は主として細胞質に局在し、ユビキチン化をうけていない未修飾型Rad18は核内に局在することが明らかとなった。これらの実験結果は、過剰なRad18をモノユビキチン化することで核から排除し、核内のRad18の量を調節している可能性を示す。

与其他损伤相比，紫外线诱导的嘧啶二聚体的修复效率较差，并且经常抑制DNA复制的进展。 RAD18被证明参与了聚合酶η的诱导，这与PCNA在终止位置的单次泛素化与RAD6结合使用。在SDS-PAGE中检测到Rad18蛋白为两个频段。质谱法表明，与85KD相对应的分子物种是对应于75KD的另一种分子物种，该物种已被单液化。为了阐明RAD18的单泛素化机制，将点突变引入了分子内的环指区域（RFD）和Zn指的区域（ZFD），并将这些突变体rad18蛋白的单次素化与野生类型进行了比较。发现野生型RAD18蛋白会根据RAD6蛋白的表达水平促进单不会泛素化，而ZFD突变体形式几乎不再显示单不会显示单泛素化，并且RFD突变体形式迅速降解，从而显着降低表达水平。此外，缺少RAD6结合位点（R6BD）的RAD18在野生型细胞中是单液化的，而在rad18^< - / - >小鼠细胞中并未单液化。另一方面，已经揭示了ZFD突变体Rad18在两个细胞中均未单喹。此外，对酵母中两性杂交方法的分析表明，Rad18蛋白在ZFD中形成二聚体。基于这些实验结果，提出了以下模型。 RAD18通过R6BD与RAD6结合，同时通过ZFD形成二聚体。二聚体中的一个RAD18由与Rad6结合的另一个Rad18单素异。此外，使用免疫染色和生化方法分析了这两种类型的RAD18蛋白的亚细胞定位，并且据透露，单泛素化的RAD18主要定位于细胞质中，而未修改的RAD18，尚未被泛液化为核核。这些实验结果表明，过度的RAD18可以单次夸夸其二，以将其从细胞核中清除，并调节核中RAD18的量。