色素性乾皮症細胞におけるDNA修復に関与する欠損因子の精製とその機能の解析

着色性干皮病细胞DNA修复缺陷因子的纯化及其功能分析

基本信息

批准号：
60227011
负责人：
山泉克
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1985
资助国家：
日本
起止时间：
1985 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-60227011/
关键词：
色素性乾皮症紫外線照射 DNA修復 A因子

项目摘要

色素性乾皮症(XP)には現在A〜Iまでの9つの遺伝的相補性群が知られている。このうち臨床症状が最も重篤でしかも日本において発症頻度が最も高いA群XP細胞における欠損因子を部分精製し以下の知見を得た。精製の出発材料は主として攪拌培養して得られたHeLa細胞を使用した。これをホモジェナイズした後、高イオン強度下で核内タン白を溶出したものを粗細胞抽出液とした。A群欠損因子(A因子)の活性測定は細胞抽出液をA群XP細胞の細胞質に注射し、紫外線照射した後【^3H】-チミジンで2.5時間ラベルし、オートラジオグラフィーにより不定期DNA合成(UDS)の有無として調べた。活性は核内グレイン数により◆〜◆までの5段階に分けて定量化した。HeLa細胞抽出液を注入することにより、A群XP細胞のUDSは正常レベルまで回復し、また紫外線に対しても抵抗性を示すようになる。抵抗性を獲得するに要するA因子量は、正常レベルのUDSを示すに要する量の約4倍必要であった。A因子を注射して約2時間後にUDS量は最高値を示し、以後約14時間の半減期で活性は減少していった。A因子の自然状態での分子量は、ゲル濾過(G-200)での各分画のA活性測定の結果16万と9万であった。これら2つの活性分画を濃縮し、BからHまでの遺伝的相補性群に属するXP細胞に注射してUDS回復の有無により、それらの特異性を調べた所、A群にのみ有効であることが判明した。A因子は粗細胞抽出液の状態では極めて安定で4℃保存で少くとも4ヶ月は活性の損失がほとんどない。またA因子はタン白分解酵素により失活し、RNaseには抵抗性であることから恐らくタン白であると推定される。A因子はまた核細胞質にほぼ同一濃度で存在し、細胞当りの総量は紫外線に抵抗性を示すのに必要な量の少くとも10倍は存在していることも判明した。現在、高速液クロ等を使い、A因子の比活性を約200倍まで上昇させるまで部分精製することが可能となり、その活性を解析中である。

心虫色素色素（XP）目前具有九个遗传互补组，从A到I，A组XP细胞中具有最严重的临床症状并且在日本最常见的A组中的有缺陷因素被部分纯化以获得以下发现。纯化的起始材料主要用于通过搅拌培养获得的HeLa细胞。将其化为匀浆，然后在高离子强度下洗脱核内蛋白，然后使用粗细胞提取物。为了测量A组缺乏因子的活性（因子A）的活性，将细胞提取物注入A组XP细胞的细胞质中，用紫外线照射，然后用[^3H] - 胸腺定胺标记2.5小时，然后通过自显影检查，以进行非规则DNA合成（UDS）。根据核晶粒的数量，从◆到◆◆分为五个阶段进行了量化活动。通过注入HeLa细胞提取物，A组中的UDS XP细胞恢复到正常水平，并且对紫外线也具有抗性。获得电阻所需的因子的量约为表现正常UDS所需的四倍。注射因子A后约2小时，UD的量达到了最高水平，半衰期约为14小时后的活动减少。通过凝胶过滤（G-200）确定因子A的天然分子量，以确定每个馏分的活性。将这两个活性分数浓缩并注入属于B到H遗传互补性基团的XP细胞，以通过UDS恢复的存在或不存在UDS恢复来检查它们的特异性，并且发现仅在A组中有效，在粗细细胞提取物的状态下，该因子A在4°C下的活性损失至少几乎没有活性。此外，因子A被蛋白酶停用，对RNase具有抗性，因此假定它是蛋白质。还发现因子A在核细胞质中的浓度大致相同，每个细胞的总量至少是耐紫外线的至少10倍。当前，可以使用高速液相色谱法进行部分纯化，直到因子A的特定活性增加了约200倍，并且目前正在分析其活性。