カテプシンEの生合成と細胞内輸送および局在化機構の解析

组织蛋白酶E的生物合成、细胞内转运及定位机制分析

• 批准号: 09267227
• 负责人: 山本 健二
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09267227/
• 关键词: カテプシンE; アスパラギン酸プロテアーゼ; 生合成; プロセシング; ミクログリア; 胸腺細胞; フレンド細胞; CHO細胞

本研究では、ラットミクログリア細胞やマウス白血病フレンド細胞、ラット胸腺細胞やカテプシンE遺伝子を導入したCHO細胞といった異なる細胞種を用いてカテプシンEの細胞内輸送と選別機構およびプロセシング機構を分子細胞生物学的に解析した。各細胞に対し[^<35>S]メチオニンを用いたパルスチェイス実験を行い、経時的に細胞と培養上清を回収し、両者に含まれるカテプシンEを特異的なポリクロナール抗体で免疫沈降し、沈降物をSDS-ゲル電気泳動とフルオログラフィーによって解析した。その結果、(1)ミクログリア細胞においては、カテプシンEはプロ型酵素として合成された後、チェイス4時間後には中間体を経て成熟型分子へと変換することがわかった。この間、糖鎖は高マンノース型から複合型へと修飾された。このプロセシングはプロトンポンプの阻害剤であるバフィロマイシンA1によって強く阻害された。免疫電顕による観察で、本酵素の大部分がエンドソーム様の空胞構造に存在していることが確認されたことから、本酵素は最終的にはエンドソーム様の酸性コンパートメントで成熟型酵素への変換が起こっていることがわかった。(2)胸腺細胞では、カテプシンEは複合型糖鎖をもつ中間型までプロセスされるが、成熟型酵素への変換はチェイス72時間後でも観察されなかった。しかし、デキサメサゾンを投与すると、胸腺の萎縮に伴い成熟型カテプシンEが強く観察された。免疫電顕による観察では、正常な胸腺細胞のカテプシンEはゴルジ体および小胞体に認められるが、デキサメサゾン処理によってかなりの部分がエンドソーム様オルガネラに移行することがわかった。(3)フレンド細胞やカテプシンE遺伝子を導入したCHO細胞では、本酵素は高マンノース型糖鎖をもつプロ型分子として大部分が小胞体に存在していた。これらの結果から、カテプシンEは細胞特異的なプロセシングを受けて、それぞれの最終局在部位に輸送されることがわかった。

本研究利用转染组织蛋白酶E基因的大鼠小胶质细胞、小鼠白血病Friend细胞、大鼠胸腺细胞、CHO细胞等不同细胞类型，利用分子和细胞研究组织蛋白酶E的细胞内转运、分选和加工机制。生物学方法进行了分析。对各细胞进行使用[^ 35 S]甲硫氨酸的脉冲追踪实验，随时间收集细胞和培养上清液，并用特异性多克隆抗体对两者中含有的组织蛋白酶E进行免疫沉淀，并分析沉淀物。 SDS-凝胶电泳和荧光照相。结果，我们发现（1）在小胶质细胞中，组织蛋白酶E作为酶原被合成，然后在追踪后4小时通过中间体转化为成熟分子。在此期间，糖链从高甘露糖型修饰为复合型。该过程受到质子泵抑制剂巴弗洛霉素 A1 的强烈抑制。免疫电镜观察证实，这种酶大部分存在于类内体的液泡结构中，因此，这种酶最终在类内体的酸性室中转化为成熟的酶。 (2)在胸腺细胞中，组织蛋白酶E被加工成具有复杂糖链的中间形式，但即使在追踪72小时后也没有观察到向成熟酶的转化。然而，当给予地塞米松时，强烈观察到成熟的组织蛋白酶E以及胸腺萎缩。免疫电镜显示，正常胸腺细胞中的组织蛋白酶 E 存在于高尔基体和内质网中，但在地塞米松处理后，很大一部分转移到内体样细胞器中。 (3)在导入组织蛋白酶E基因的Friend细胞和CHO细胞中，该酶主要作为具有高甘露糖糖链的原型分子存在于内质网中。这些结果表明组织蛋白酶 E 经历细胞特异性加工并被转运至其最终定位位点。

项目成果

山本健二外: "プロテオリシス-蛋白質分解の分解機構とバイオロジー" 蛋白質・核酸・酵素. 42. 2425-2432 (1997)

Kenji Yamamoto 等人：“蛋白质分解 - 蛋白质降解的降解机制和生物学”蛋白质、核酸和酶。 42. 2425-2432 (1997)

Okamura K.et al.: "Immunohistochemical localization of cathepsin D,proliferating cell nuclear antigen and epidamal growth factor receptor in human breast carcinoma analyzed by computer image analyzer" Histopathol.31. 540-548 (1997)

Okamura K.等人：“通过计算机图像分析仪分析人乳腺癌中组织蛋白酶 D、增殖细胞核抗原和表皮生长因子受体的免疫组织化学定位”Histopathol.31。

kunimatsu K.et al.: "Immunohistochemical study on cathepsin G and medullasin in inflamed gingival tissues from periodontal patinets" J.Periodont.Res.32. 264-270 (1997)

kunimatsu K.等人：“牙周病发炎牙龈组织中组织蛋白酶 G 和髓质素的免疫组织化学研究”J.Periodont.Res.32。

Nakayama K.et al.: "Hemoglobin receptor protein is intragenetically encoded by the cysteine proteinase-encoding genes and the haemagglutinin-encoding gene of Porphyromonas gingivalis" Mol.Microbiol.27. 51-61 (1998)

Nakayama K.等人：“血红蛋白受体蛋白是由牙龈卟啉单胞菌的半胱氨酸蛋白酶编码基因和血凝素编码基因在遗传内编码的”Mol.Microbiol.27。

Okamoto K.et al.: "Proteolysis in Cell Functions" IOS Press(Hopsu-Have VK,Javinen M,Kirschke H,eds.), 576 (1997)

Okamoto K.等人：“细胞功能中的蛋白水解”IOS Press（Hopsu-Have VK，Javinen M，Kirschke H，eds.），576（1997）