細胞内アスパラギン酸プロテアーゼの選別と輸送機構

细胞内天冬氨酸蛋白酶的分选和转运机制

• 批准号: 06248223
• 负责人: 山本 健二
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06248223/
• 关键词: 細胞内アスパラギン酸プロテアーゼ; プロセシング; カテプシンE; カプテシンD; 細胞内輸送; 活性化機構; マウス白血病フレンド細胞; チャイニーズハムスター卵巣細胞

カテプシンEはカテプシンDとともに主要な細胞内アスパルティックプロテアーゼである。本酵素の細胞内輸送とソーティング機構については全く解明されていない。本研究ではまずカテプシンEのプロテオリティクプロセッシングと活性化機構を検討するため、ヒト赤血球膜およびラット脾臓から前駆体プロカテプシンEを分解精製し、成熟酵素への変換機構をin vitroで解析した。同時に、ラット脾臓からカテプシンEの遺伝子のクローニングを行い、そのヌクレオチド配列から蛋白質一次構造を決定した。続いて、マウス白血病フレンド細胞およびヒトカテプシンE遺伝子を移入したCHO細胞を用いたパルスチェイス実験によってカテプシンEのプロセシングと細胞内輸送経路を調べ、リソソーム酵素のカテブシンDのそれと対比させた。本研究を通じて得られた結果は以下のとうりである。(1)ヒト赤血球膜およびラット脾臓から分離精製したプロカテプシンEのN末端アミノ酸はそれぞれSer^3およびGln^1であった。(2)両プロカテプシンEとも緩和な酸性条件下で主として分子間反応によって急速に成熟型酵素に変換されることが判った。(3)ラットカテプシンEは19個のアミノ酸残基からなるシグナルペプチド、39個のアミノ酸残基からなるプロペプチドならびに337個のアミノ酸残基からなる成熟ドメインから成っており、1個のNグリコシド糖鎖の結合部位を持つ糖蛋白質であった。(4)成熟赤血球では本酵素は細胞膜の細胞質側に膜結合型の不活性酵素として存在しているが、未分化のフレンド細胞では膜結合型の酵素とともに細胞質型の酵素として存在する。(5)フレンド細胞ではカテプシンEは合成後の比較的早い時期に糖鎖の修飾を受け高マンノース型から複合型糖鎖へ変換するが、プロテオリティックプロセシングは非常に遅いか殆ど起こらないことが判った。(6)CHO細胞ではカテプシンEは高マンノース型糖鎖を維持して複合型糖鎖への変換を示さないが、プロ型から中間体そして微量ではあるが成熟型酵素への変換が見られた。(7)電子顕微鏡を用いた観察から、CHO細胞ではカテプシンEは小胞体およびエンドソームに主として観察され、一部細胞質への局在も見られた。

组织蛋白酶E以及组织蛋白酶D是主要的细胞内天冬氨酸蛋白酶。该酶的细胞内转运和分类机制尚未阐明。在这项研究中，我们首先研究了组织蛋白酶E的蛋白水解处理和激活机制，并纯化了人类红细胞膜和大鼠脾脏的前体procathepsin e，并分析了在体外成熟酶的转化机制。同时，从大鼠脾脏克隆了组织蛋白酶E的基因，并根据其核苷酸序列确定一级蛋白质结构。接下来，我们通过使用脉冲追逐实验进行了使用小鼠白血病 - 朋友细胞和与人类组织蛋白酶E基因转移的CHO细胞对组织蛋白酶E和细胞内转运途径的加工，并将其与溶酶体酶Cathebusin D进行了比较。红细胞膜和大鼠脾脏分别为Ser^3和Gln^1。 （2）发现两种过程均快速转化为成熟的酶，主要通过弛豫的酸性条件下的分子间反应。 （3）大鼠组织蛋白酶E是由由19个氨基酸残基组成的信号肽组成的糖蛋白E，由39个氨基酸残基组成，由39个氨基酸残基组成，以及一个由337个氨基酸残基组成的成熟结构域，由一个N-Glycoside Glycan的结合位点组成，由糖蛋白具有糖蛋白。 （4）在成熟的红细胞中，该酶作为细胞膜细胞质侧的一种膜结合的非活性酶存在，但是在未分化的朋友细胞中，它作为一种细胞质酶与膜结合的enzyme一起存在。 （5）在朋友细胞中，组织蛋白酶经过糖基化修饰，并在合成后相对早期的阶段从高甘露糖转换为复杂的糖基化，但发现蛋白质处理非常缓慢或很难发生。 （6）在CHO细胞中，组织蛋白酶e保持高甘露糖型聚糖，并未显示向复杂的聚糖的转化，而是从亲形式转化为中间体，尽管有痕量，但观察到成熟的酶。 （7）从使用电子显微镜的观察结果中，主要在内质网中观察到组织蛋白酶E和CHO细胞中的内体，并且还部分观察到细胞质的定位。