ヒトセントロメア領域特異的ヌクレオソーム構造が形成する高次構造体の解析

人类着丝粒区域特异性核小体结构形成的高阶结构分析

基本信息

批准号：
09263206
负责人：
依田欣哉
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09263206/
关键词：
CENP-A ヌクレオソームモノクローン抗体セントロメア

项目摘要

ヒト細胞由来セントロメアDNA(αサテライト)及びセントロメア蛋白CENP-A,CENP-Bを用いたin vitro再構成実験によって得られた結果から我々はセントロメア特異的ヌクレオソーム構造の存在を提唱している。この構造を基礎として形成される高次構造体がセントロメア機能に関わるものと推測している。セントロメア特異生とは次の3点である。(1)セントロメア特異的ヒストンH3=CENP-Aの関与、(2)ヌクレオソーム構造のボジショニング:1ヌクレオソームユニットが1αサテライトユニット(171bp)に対応していることを示した。(3)CENP-Bboxを持つaサテライトDNAの規則性:HeLa細胞において大部分のCENP-Bboxが二回に一回規則的に繰返し出現していることを示した。我々は現在Woodcock等によって提唱されているzig-zag nucleosomal ribbon構造に注目している。このモデルにヌクレオソーム構造のポジショニングという条件を当てはめると極めて特異的な構造、しかも繰返しDNA配列を反映した規則性を持つ高次構造の成立を容易に想像する事ができる。以上の作業仮説を実証し高次構造の規則性を検証し、さらにセントロメア機能との関わりを解析する目的で、我々はさらに大量かつ高純度のセントロメア蛋白質の精製を試みた。大腸菌を用いたタンパク質発現系を利用してCENP-Aを精製する事ができた。しかし精製されたCENP-Aは細胞由来CENP-Aとは明かにSDS-PAGEにおける移動度が異なり、翻訳後の修飾が異なることを予想させる結果であった。そこでバキュロヴィールスによる発現系を用いて真核生物の修飾基の存在するCENP-Aの発現精製を試み成功した。さらCENP-B及びCENP-Cについても同じ発現系を用いて調整する予定である。また極めて特異性の高い抗CENP-Aモノクローン抗体の作製に成功した。

我们提出了通过使用人类细胞衍生的Centromere DNA（Alpha卫星）和Centromere蛋白CENP-A和CENP-B获得的，从体外重建实验获得的共有丝粒特异性核小体结构的存在。据推测，由于centromeric函数涉及基础，因此在此结构上形成的高阶结构。 Centromere奇异寿命是以下三个点：（1）丝粒特异性组蛋白H3 = CENP-A，（2）核小体结构的身体：我们证明了一个核小体单位对应于1α卫星单位（171 BP）。（3）携带CENP-bbox的卫星DNA的规律性：我们表明，大多数CENP-bboxes在HeLa细胞中每两次定期出现一次。我们关注的是Woodcock等人目前提出的锯齿形核体缎带结构。将核小体结构定位的条件应用于该模型，很容易想象建立高度特异性的结构，以及具有反映重复DNA序列的高阶结构。为了证明上述工作假设，请验证高阶构象的规律性，并进一步分析其与丝粒功能的关系，我们试图净化大量高纯度centromeric蛋白。使用大肠杆菌使用蛋白质表达系统纯化CENP-A。然而，纯化的CENP-A在SDS-PAGE中与细胞衍生的CENP-A的迁移率显然有所不同，这预测翻译后修饰会有所不同。因此，我们成功地尝试使用使用baculoviels的表达系统纯化CENP-A的表达，该CENP-A的表达是经过改进的。此外，将使用相同的表达系统调整CENP-B和CENP-C。此外，我们成功地产生了具有极高特异性的抗Cenp-A单克隆抗体。