HIVの増殖にかかわるTNFシグナル伝達因子変異細胞株の樹立と解析

HIV增殖相关TNF信号因子突变细胞系的建立及分析

• 批准号: 08269208
• 负责人: 松山 俊文
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08269208/
• 关键词: TNF; NF-_kB; エイズ; HIV増殖機構; 変異細胞株

T細胞におけるTNFからNF-_kBの活性化への経路の解明はエイズにおけるHIVの増殖機構の理解への重要なステップであると考えられる.本研究では、TNFのシグナリングの内でNF-_kBの活性化にいたる経路に焦点を絞ってヒト細胞株を用いて検討する.そのためTNFの刺激からNF-_kBの活性化にいたる経路が障害されている細胞株を樹立し、次にcDNAの導入によってその経路が回復してくる亜株を分離してくるといったインターフェロンのイグナル伝達分子の解明に使われ多大な成果をあげてきたアプローチを目指している.平成9年度とTNFのシグナル伝達の変異株の樹立のためにまずHGPRT欠損した細胞株MT-2(HGPRT-),HT1080(HGPRT-)を樹立した.次にクローンされた細胞株に、HIV-LTRをプロモーターに持ったgpt遺伝子(HGPRT遺伝子の作用をもつ)のプラスミドを導入してTNFとともにHAT培地下で選択を行った.ここで選択された細胞は予想通りHATに抵抗性となり、一方8-AG存在下では生育できない.現在、この細胞株が実際にTNF受容体からNF-_kB活性化の経路が正常であればgpt遺伝子の発現によってHAT抵抗性を獲得したのか、それともrevertantとなり親株の性質をもつものに戻ったのかを検討中である.またHT1080細胞ではTNFによるtrans-activationがかかりにくいためTNFによってより強いgpt遺伝子の発現がおこる系を開発中である.これらをふまえた上で来年度はフレームシフト変異原であるICR-191を処理してTNF受容体からNF-_kB活性化の経路にある分子に変異をおこすことを試み、更にその変異をrescueする分子を導入したcDNAライブラリーの中から同定する予定にしている.

阐明 T 细胞中从 TNF 到 NF-kB 激活的途径被认为是了解艾滋病中 HIV 增殖机制的重要一步，我们将重点关注使用人类细胞系导致激活的途径。将建立一个细胞系，其中从 TNF 刺激到 NF-_kB 激活的途径受到损害，然后将 cDNA 引入该细胞系中，该途径将被恢复。我们的目标是使用在阐明干扰素信号转导分子方面取得巨大成功的方法，例如分离 TNF 缺陷细胞系 MT-2 (HGPRT-) 和 HT1080 (HGPRT-)。向细胞系注射gpt基因（具有HGPRT基因的作用），其启动子中带有HIV-LTR。引入质粒并在含有 TNF 的 HAT 培养基中进行选择。这里选择的细胞如预期一样对 HAT 具有抗性，但在 8-AG 存在的情况下无法生长。目前，该细胞系实际上已被证明是我们目前正在研究如果受体的 NF-_kB 激活途径正常，HAT 抗性是否是通过 gpt 基因表达获得的，或者细胞是否会变成回复体并恢复到亲本菌株的特性。我们目前正在开发一种系统，其中 gpt 基因表达因 TNF 而更强，因为它不易受 TNF 反式激活的影响。基于此，明年我们将使用移码诱变剂 ICR-191 来增加 TNF 受体。他们计划在体内 NF-kB 激活途径中的分子中产生突变，然后从引入的 cDNA 文库中鉴定出可以挽救突变的分子。