転写制御タンパク質の大腸菌による大量発現および高次構造に基づく機能解析

转录调控蛋白在大肠杆菌中的大规模表达及基于高阶结构的功能分析

• 批准号: 09249202
• 负责人: 菊池 康夫
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09249202/
• 关键词: DNA結合タンパク質; 転写因子; Zn・フィンガー; PAS

本研究は薬物代謝酵素P4501A1の発現を調節する転写制御タンパク質の機能ドメインを大腸菌を用いて大量発現させ、精製の後、タンパク質の高次構造解析の結果と関連づけて作用機構を解析することが目的である。P-4501A1遺伝子の転写制御領域は2種類あり、BTE(Basic trans-criptional element)は構成的発現に、XRE(Xenobiotic responsive element)は誘導的発現に必要である。各々の領域には特異的な転写制御タンパク質が結合して転写を調節する。BTEに結合する転写因子BTEBのDNA結合領域は3回連続するZn-フィンガーモチーフとそのN末端側に隣接する塩基性配列を含む。このDNA結合領域の大腸菌での大量発現・精製を完了し、キャラクタリゼーションの結果を報告した。13-C、15-Nでダブルラベルしたタンパク質の高次構造は東京都臨床医学総合研究所の稲垣冬彦博士の協力により、三重共鳴三次元NMR法による解析が進行中である。現在、約70%のシグナルの同定が完了した。さらにこのタンパク質とDNAとの複合体の高次構造解析も開始した。これによりタンパク質とDNAの相互作用をより詳細に理解できると期待される。P4501A1の誘導的発現に必要なXRE領域に結合するタンパク質はAhR(Arylhydrocarbon Receptor)とArnt(AhR nuclear translocator)のヘテロ二量体である。両タンパク質はDNA結合ドメイン(bHLH)、リガンド結合ドメイン(PAS)、二量体形成ドメイン(bHLH+PAS)をもつ新しいタイプの受容体型転写因子である。すでに、両者のbHLH+PASドメインを大腸菌で発現させ、DNA結合活性をもつヘテロ二量体の形成に成功した。しかし、大量発現を試みると大部分が不溶性となり高次構造解析に適した試料の調製は困難であった。そこで、GST-やHis-タグドメインはタンパク質の精製には都合が良いが不溶性の原因になると考え、これらを含めずに目的の配列のみからなるタンパク質を発現させてこの問題点を解決しようと検討中である。

这项研究是为了调节转移控制蛋白的功能，该蛋白可以使用大肠杆菌调节药物代谢酶的表达，然后根据蛋白质的高阶结构分析作用机制。 P-4501a1基因转移区域有两种类型，BTE（基本的转移元件）需要配置，XRE（Xenobiotic响应元件）被诱导。每个区域是特定的转录控制蛋白结合以调整转录的。转录因子BTEB与BTE结合的DNA结合区域包含一个Zn手指基序三个连续的Zn手指基序和其N端侧的相邻基本序列。该DNA结合区域中的质量表达和纯化完成了大肠杆菌的质量表达和纯化，并报告了表征的结果。随着东京临床医学研究所的Fuyuhiko Inagaki博士的合作，在东京大都会研究所的三维NMR方法正在进行MIE共鸣3D NMR方法。目前，大约有70％的信号被确定。另外，该蛋白质和DNA的较高阶结构分析已经开始。结果，可以详细了解蛋白质与DNA之间的相互作用。 P4501a1诱导表达所需的XRE区域的蛋白质是AHR（芳基水合碳受体）和ARNT（AHR核转运剂）的杂体。两种蛋白质都是具有DNA结合结构域（BHLH），配体结合结构域（PAS）和双体形成域（BHLH+PAS）的新型受体转录因子。两侧的BHLH+PAS结构域已经在大肠杆菌中表达，并且具有DNA键活性的异质体的形成成功。但是，当试图变大时，大多数人都无法解决，因此很难准备适合更高阶结构分析的样品。因此，GST和HIS标签结构域被认为是蛋白质纯化的方便，但会导致不溶性，因此我们考虑通过仅表达仅由所需序列组成的蛋白质来解决此问题。