転写制御タンパク質機能ドメインの大量発現および高次構造解析

转录调节蛋白功能域的大规模表达和构象分析

• 批准号: 11160201
• 负责人: 菊池 康夫
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11160201/
• 关键词: DNA結合タンパク質; 転写因子; PASドメイン

受容体型転写因子AhR(Aryl hydrocarbon receptor)はダイオキシンなど外来の多環性芳香族化合物を結合した後、Arnt(AhR nuclear translocator)とヘテロ二量体を形成して薬物代謝酵素CYPlA1遺伝子の誘導的転写調節配列XRE(Xenobiotic responsive element)に結合して転写を活性化する。AhR、ArntともにPAS(Per-AhR/Arnt-Sim homology)という新しい構造モチーフを持つ。PASはサブドメインPAS-A、PAS-Bを含み、タンパク質間相互作用に重要な役割を持つ。本研究はPASの機能ドメインの高次構造解析を目的とした。(1)アミノ酸配列ホモロジーに基づいたPAS-A、PAS-Bは大腸菌で発現させると大部分が不溶性だったがマウスArnt2のPAS-Aは可溶性で精製も進んだ。しかし巨大な会合体を形成したため1残基含まれるCysをSerに変換したところ高次会合体形成は抑制され、AhR-Arntヘテロ二量体の形成を競合的に阻害する活性も示したのでCys-Ser変換は有効な対策であった。しかし依然として4〜6量体なのでオクチルグルコシド、Tween20などの界面活性剤を加えると、二量体の形成が特に強まり規則性のより高い構造をとった。稲垣冬彦教授(北大)のご協力によりNMR高次構造解析に着手した。(2)SDS-PAGEと非変性PAGEの結果からこのタンパク質は電荷的にも分子量的にも均一なので会合の様式も均一と結論した。これにより均一な会合体を結晶化しX線結晶解析を適用する可能性が明らかになった。(3)アミノ酸配列ホモロジーによらずにインタクトな構造フレームに合致した構造ドメインを確定するには全長のタンパク質をタンパク質分解酵素で限定消化する必要がある。星川裕博士(都臨床研)のご協力を得てArnt全長タンパク質の昆虫細胞Sf9での発現量を大幅に増加させることに成功した。

受体型转录因子AhR（芳基碳氢化合物受体）与二恶英等外来多环芳香族化合物结合后，与Arnt（AhR核转位子）形成异二聚体，诱导药物代谢酶CYPlA1基因的转录并与其调节结合。序列 XRE（异生素反应元件）并激活转录。 AhR 和 Arnt 都有一个新的结构基序，称为 PAS（Per-AhR/Arnt-Sim 同源性）。 PAS 包含子结构域 PAS-A 和 PAS-B，在蛋白质-蛋白质相互作用中发挥重要作用。本研究的目的是分析PAS功能域的高阶结构。 (1)基于氨基酸序列同源性的PAS-A和PAS-B在大肠杆菌中表达时大多不溶，但小鼠Arnt2 PAS-A是可溶的并被纯化。然而，由于形成了巨大的聚集体，当一个残基中的Cys转化为Ser时，高阶聚集体的形成受到抑制，并且Cys还显示出竞争性抑制AhR-Arnt异二聚体形成的活性。有效的对策。但由于仍然是四六聚体，当添加辛基葡萄糖苷、吐温20等表面活性剂时，二聚体的形成特别加强，从而形成更加规则的结构。在稻垣冬彦教授（北海道大学）的合作下，我们开始了NMR高阶结构分析。 (2)从SDS-PAGE和非变性PAGE的结果来看，该蛋白的电荷和分子量均一，因此缔合方式也均一。这揭示了均匀聚集体结晶和应用 X 射线晶体学的可能性。 (3)为了不依赖氨基酸序列同源性来确定与完整结构框架匹配的结构域，需要用蛋白水解酶对全长蛋白进行有限消化。在Yutaka Hoshikawa博士（东京临床研究所）的合作下，我们成功显着提高了昆虫细胞Sf9中全长Arnt蛋白的表达水平。