転写制御タンパク質機能ドメインの大量発現および高次構造解析

转录调节蛋白功能域的大规模表达和构象分析

• 批准号: 11160201
• 负责人: 菊池 康夫
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11160201/
• 关键词: DNA結合タンパク質; 転写因子; PASドメイン

受容体型転写因子AhR(Aryl hydrocarbon receptor)はダイオキシンなど外来の多環性芳香族化合物を結合した後、Arnt(AhR nuclear translocator)とヘテロ二量体を形成して薬物代謝酵素CYPlA1遺伝子の誘導的転写調節配列XRE(Xenobiotic responsive element)に結合して転写を活性化する。AhR、ArntともにPAS(Per-AhR/Arnt-Sim homology)という新しい構造モチーフを持つ。PASはサブドメインPAS-A、PAS-Bを含み、タンパク質間相互作用に重要な役割を持つ。本研究はPASの機能ドメインの高次構造解析を目的とした。(1)アミノ酸配列ホモロジーに基づいたPAS-A、PAS-Bは大腸菌で発現させると大部分が不溶性だったがマウスArnt2のPAS-Aは可溶性で精製も進んだ。しかし巨大な会合体を形成したため1残基含まれるCysをSerに変換したところ高次会合体形成は抑制され、AhR-Arntヘテロ二量体の形成を競合的に阻害する活性も示したのでCys-Ser変換は有効な対策であった。しかし依然として4〜6量体なのでオクチルグルコシド、Tween20などの界面活性剤を加えると、二量体の形成が特に強まり規則性のより高い構造をとった。稲垣冬彦教授(北大)のご協力によりNMR高次構造解析に着手した。(2)SDS-PAGEと非変性PAGEの結果からこのタンパク質は電荷的にも分子量的にも均一なので会合の様式も均一と結論した。これにより均一な会合体を結晶化しX線結晶解析を適用する可能性が明らかになった。(3)アミノ酸配列ホモロジーによらずにインタクトな構造フレームに合致した構造ドメインを確定するには全長のタンパク質をタンパク質分解酵素で限定消化する必要がある。星川裕博士(都臨床研)のご協力を得てArnt全長タンパク質の昆虫細胞Sf9での発現量を大幅に増加させることに成功した。

受体转录因子AHR（芳基烃受体）结合外源多环芳香族化合物，例如二恶英，然后形成具有ARNT（AHR核转运剂）的异二聚体，并与异种生物源反应元件（XRE）结合，用于药物代谢酶Cypla1 Gene，从而使转录具有激活的转录。 AHR和ARNT都有一个称为PAS的新结构图案（PER-AHR/ARNT-SIM同源性）。 PAS包括子域PAS-A和PAS-B，在蛋白质 - 蛋白质相互作用中起重要作用。这项研究旨在分析PAS功能域的结构顺序。 （1）基于氨基酸序列同源性的PAS-A和PAS-B在大肠杆菌中表达时大多不溶于溶解，但是小鼠ARNT2中的PAS-A可溶并纯化。但是，由于形成的巨大关联，含有一个残基的Cys被转换为SER，也抑制了较高关联的形成，并且还显示了竞争性抑制AHR-ARNT异二聚体形成的活性，因此CYS-SER转换是一个有效的度量。但是，由于仍然存在4-6六聚体，因此添加诸如辛基葡萄糖苷和Tween20之类的表面活性剂会特别加强二聚体形成和具有较高规律性的结构。随着伊纳加基·富尤希科（Inagaki Fuyuhiko）教授（北海道大学）的合作，我们开始对NMR高阶结构进行分析。 （2）从SDS-PAGE和非定义页面的结果中，可以得出结论，缔合模式是均匀的，因为该蛋白在电荷和分子量均均匀。这揭示了结晶均匀关联并应用X射线晶体学的可能性。 （3）确定与完整结构框架相匹配的结构域，无论氨基酸序列同源性如何，都必须限制使用蛋白水解酶消化全长蛋白。随着Hoshikawa Hiroshi博士（东京临床研究所）的合作，我们成功地显着提高了昆虫细胞SF9中ARNT全长蛋白的表达水平。