大腸菌による転写制御タンパク質の大量発現と高次構造解析

大肠杆菌转录调节蛋白的大规模表达和高阶结构分析

基本信息

批准号：
07268201
负责人：
菊池康夫
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07268201/
关键词：
DNA-結合タンパク質転写因子 Zn-フィンガー bHLH PAS

项目摘要

本研究は外来薬物代謝酵素P4501A1の発現調節に関与する転写制御タンパク質群を大腸菌で大量発現させ高次構造と機能を解析することを目的とする。P-4501A1の遺伝子5′上流には構成的発現に関与するBTE(Basic transcriptional element)、誘導的発現に必要なXRE(Xeno biotic responsive element)の2種類の転写制御領域があり、各々に転写制御タンパク質が結合する。BTEに結合する転写因子BTEBのDNA結合ドメインは3回連続するZn-フィンガーモチーフとそのN末端に隣接する塩基性の領域から成る。この部分構造を大腸菌で大量発現させ、精製を完了した。13-C、15-Nでダブルラベルしたタンパク質とDNAとの複合体の高次構造は東京都臨床医学総合研究所の稲垣冬彦博士との共同研究で、三重共鳴三次元NMR法により順調に進行中である。別途、このタンパク質のキャラクタリゼーションを進めた。DNA複合体の解離定数は5nMで、アポタンパク質にDNA結合活性を回復させる金属イオンの効果はZn>Co≫Cd、Niであった。また、このタンパク質は濃度依存的ホモ二量体形成を行うことを見いだした。DNA結合活性とこれらの性質が高次構造の解明によりいっそうよく理解されることが期待される。XREに結合するタンパク質はAhR(Arylhydrocarbon Receptor)とArnt(AhR nuclear translocator)のヘテロ二量体である。両タンパク質はDNA結合ドメイン(bHLH)、リガンド結合ドメイン(PAS)、二量体形成ドメイン(bHLH+PAS)をもつ新しいタイプの転写因子である。両者のbHLH+PASドメインを大腸菌で発現させることに成功した。精製の後DNA結合活性をもつヘテロ二量体を形成することにも成功した。構造解析に適する部分構造の大量発現系の確立を目指して検討を続けている。

这项研究旨在通过表达大量的转录调节蛋白来分析高阶结构和功能，其中涉及外国药物代谢酶P4501A1在大肠杆菌中的表达。 P-4501A1基因的上游，有两种类型的转录调节区域：与本构表达有关的BTE（基本转录元件），诱导表达所需的XRE（Xeno Biotic Resportive元件），以及转录调节性调节性蛋白质蛋白与它们的每一个结合。结合BTEB的转录因子BTEB的DNA结合结构域由三个连续的Zn手指基序和一个基本区域组成。该子结构在大肠杆菌中大量表示，并完成了纯化。蛋白质复合物的较高级结构与13-C和15-N和DNA双重标记的较高结构使用三维NMR方法平滑地进行，并与东京临床医学研究所的Inagaki Fuyuhiko博士合作。该蛋白的表征分别进行。 DNA复合物的解离常数为5 nm，金属离子恢复DNA结合活性与载载蛋白的作用为Zn> co≫CD和Ni。还发现该蛋白经历浓度依赖性同型二聚体的形成。预计DNA结合活性及其特性将通过阐明高阶结构来更好地理解。与XRE结合的蛋白质是AHR（芳烃受体）和ARNT（AHR核转运剂）的异二聚体。两种蛋白质都是具有DNA结合结构域（BHLH），配体结合结构域（PAS）和二聚化结构域（BHLH+PAS）的新型转录因子。两个BHLH+PAS结构域在大肠杆菌中成功表达。纯化后，它也成功地形成具有DNA结合活性的异二聚体。我们正在继续进行调查，目的是建立适合结构分析的部分结构的大规模表达系统。