大腸菌による転写制御タンパク質の大量発現と高次構造解析

大肠杆菌转录调节蛋白的大规模表达和高阶结构分析

基本信息

批准号：
07268201
负责人：
菊池康夫
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07268201/
关键词：
DNA-結合タンパク質転写因子 Zn-フィンガー bHLH PAS

项目摘要

本研究は外来薬物代謝酵素P4501A1の発現調節に関与する転写制御タンパク質群を大腸菌で大量発現させ高次構造と機能を解析することを目的とする。P-4501A1の遺伝子5′上流には構成的発現に関与するBTE(Basic transcriptional element)、誘導的発現に必要なXRE(Xeno biotic responsive element)の2種類の転写制御領域があり、各々に転写制御タンパク質が結合する。BTEに結合する転写因子BTEBのDNA結合ドメインは3回連続するZn-フィンガーモチーフとそのN末端に隣接する塩基性の領域から成る。この部分構造を大腸菌で大量発現させ、精製を完了した。13-C、15-Nでダブルラベルしたタンパク質とDNAとの複合体の高次構造は東京都臨床医学総合研究所の稲垣冬彦博士との共同研究で、三重共鳴三次元NMR法により順調に進行中である。別途、このタンパク質のキャラクタリゼーションを進めた。DNA複合体の解離定数は5nMで、アポタンパク質にDNA結合活性を回復させる金属イオンの効果はZn>Co≫Cd、Niであった。また、このタンパク質は濃度依存的ホモ二量体形成を行うことを見いだした。DNA結合活性とこれらの性質が高次構造の解明によりいっそうよく理解されることが期待される。XREに結合するタンパク質はAhR(Arylhydrocarbon Receptor)とArnt(AhR nuclear translocator)のヘテロ二量体である。両タンパク質はDNA結合ドメイン(bHLH)、リガンド結合ドメイン(PAS)、二量体形成ドメイン(bHLH+PAS)をもつ新しいタイプの転写因子である。両者のbHLH+PASドメインを大腸菌で発現させることに成功した。精製の後DNA結合活性をもつヘテロ二量体を形成することにも成功した。構造解析に適する部分構造の大量発現系の確立を目指して検討を続けている。

本研究的目的是在大肠杆菌中大量表达一组参与调控外源药物代谢酶P4501A1表达的转录控制蛋白，并分析其高阶结构和功能。 P-4501A1 基因上游有两种类型的转录控制区：参与组成型表达的 BTE（基本转录元件）和诱导型表达所需的 XRE（异种生物反应元件）。与 BTE 结合的转录因子 BTEB 的 DNA 结合域由三个连续的锌指基序和一个邻近 N 末端的碱性区域组成。该部分结构在大肠杆菌中大量表达并完成纯化。与东京都临床医学研究所的 Fuyuhiko Inagaki 博士合作，使用三重共振三维 NMR 成功研究了 13-C 和 15-N 双标记蛋白质与 DNA 之间的复合物的高阶结构就在里面。我们分别对这种蛋白质进行了表征。 DNA复合物的解离常数为5nM，金属离子对恢复DNA与脱辅基蛋白结合活性的影响为Zn>Co≫Cd、Ni。我们还发现该蛋白质经历浓度依赖性同二聚体形成。预计通过阐明高阶结构，将更好地理解 DNA 结合活性和这些特性。与 XRE 结合的蛋白质是 AhR（芳基烃受体）和 Arnt（AhR 核转位蛋白）的异二聚体。这两种蛋白都是新型转录因子，具有 DNA 结合域 (bHLH)、配体结合域 (PAS) 和二聚化域 (bHLH+PAS)。我们成功地在大肠杆菌中表达了 bHLH+PAS 结构域。纯化后，我们还成功形成了具有DNA结合活性的异二聚体。我们正在继续研究，旨在建立适合结构分析的子结构质量表达系统。