始原生殖細胞由来の胚幹細胞株の発生工学への応用

原始生殖细胞来源的胚胎干细胞系在发育工程中的应用

基本信息

批准号：
05275201
负责人：
松居靖久
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子ターゲッティング法では、胚幹細胞由来遺伝子の子孫への伝達率と、変異の表現形に対する遺伝的背景の影響が問題になる。こういった点を克服する目的で、代表的な近交系マウスであるC57Bl/6、Balb/c、DBA/2、C3H/He、129Sv/Jの8.5日胚の始原生殖細胞から胚幹細胞株(EG細胞)を樹立した。始原生殖細胞を膜結合型Sl因子、LIFおよびbFGFの存在下に初代、継代培養して得たEG細胞は、いずれもコロニーの形態は129Sv系統の胚盤胞から得たES細胞とよく似ており、また未分化胚幹細胞のマーカーであるアルカリ性フォスファターゼと4C9抗原を発現していることが分かった。現在これらをC57Bl/6またはBalb/cの胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラ形成能及び子孫への伝達の効率を調べている。また、EG細胞が未分化状態で安定に増殖するのに必要な、新しいキナーゼ型増殖因子レセプター遺伝子の同定を試みた。EG細胞のmRNAを材料に、キナーゼの保存配列に対するプライマーを使ってRT-PCRを行い、EG細胞や生殖巣などで特異的に発現する4種類のキナーゼ遺伝子(GCK1、2、3、4)をクローニングした。このうちGCK1、2は新しいセリン/スレオニンキナーゼを、GCK3はPolo like kinaseをコードし、またGCK4はトリv-rykと相同性のあるタンパク質をコードする事がわかった。さらにGCK2はcDNAライブラリーから、ほぼ全長をコードする3.4KbのcDNAを得、その配列から非レセプター型のセリン/スレオニンキナーゼをコードすることが明らかになった。今後EG細胞にこれらの遺伝子を導入することにより、その増殖における役割を解析する予定である。また、生殖細胞の増殖、分化における機能をトランスジェニックマウスと遺伝子ターゲッティング法により解析する予定である。

基因靶向方法涉及胚胎干细胞衍生基因向后代的传播速率以及遗传背景对突变表型的影响。为了克服这些点，从8.5天胚胎，C57BL/6，BALB/C，DBA/2，C3H/HE和129SV/J的原始生殖细胞中建立了胚胎干细胞系（EG细胞）。在存在膜结合的SL因子，LIF和BFGF的情况下，通过原始生殖细胞的原始亚培养获得的EG细胞都表明，菌落形态与从129SV谱系的胚泡中获得的形态非常相似，并且它们也表达了碱性磷酸酶和4C9抗磷酸盐，4c9抗原，标记的无分散剂量的细胞。这些目前已对C57BL/6或BALB/C胚泡进行微注射，以研究嵌合能力和向后代传播的效率。我们还试图鉴定一种新的激酶型生长因子受体基因，这对于EG细胞在未分化状态下稳定生长是必不可少的。使用EG细胞作为材料的mRNA，使用用于保守的激酶序列的引物和四种类型的激酶基因（GCK1、2、3、4）进行RT-PCR，这些基因在EG细胞和性腺中被特异性表达。发现GCK1和2编码新的丝氨酸/苏氨酸激酶，GCK3像激酶一样编码polo和GCK4与TRIV-RYK一起编码具有同源性的蛋白质。此外，GCK2获得了几乎从cDNA库中编码整个长度的3.4 kb cDNA，并且从其序列中揭示了它编码非受体型丝氨酸/苏氨酸激酶。将来，我们计划通过将它们引入EG细胞中来分析这些基因在增殖中的作用。另外，将通过转基因小鼠和基因靶向方法来分析生殖细胞增殖和分化的功能。