イヌiPS細胞由来赤血球による新規輸血療法の実現に向けた基盤技術の構築

建立利用犬iPS细胞来源的红细胞实现新型输血疗法的基础技术

基本信息

批准号：
22KJ2618
负责人：
木村和人
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2618/
关键词：
イヌ iPS細胞赤血球輸血ゲノム編集中胚葉造血幹細胞赤芽球

项目摘要

多分化能と自己複製能を有するiPS細胞は、献血ドナーに依存しない赤血球の安定供給源となりうるため、輸血用血液不足の問題を解決できると期待されている。本研究では、ゲノム編集により、赤血球マーカーレポーターイヌiPS細胞株の樹立を行うこと、およびイヌiPS細胞を用いた効率的な赤血球作製法を明らかにすることを目的としている。現在までに以下の成果が得られている。1. ゲノム編集によるレポーターイヌiPS細胞株の樹立：赤血球系譜マーカーのGYPA遺伝子座に対するガイドRNA、両側のホモロジーアーム配列、Cas9遺伝子およびGFP遺伝子を搭載したプラスミドベクターの構築に成功している。さらに、エレクトロポレーション法により作製したベクターをイヌiPS細胞へ導入することで、目的の遺伝子座へのノックインに成功したことが示唆される細胞クローンが得られている。2. イヌiPS細胞の培養条件の検討：イヌiPS細胞から赤血球を作製するうえで、イヌiPS細胞培養条件の効率化は非常に重要である。そこで、ヒト幹細胞用市販培地および足場剤がイヌiPS細胞培養へ応用可能か検討した。その結果、StemFlexまたはmTeSR Plus培地とVitronectinまたはGeltrexの足場剤を組み合わせることで、週末の培地交換なしに効率よくイヌiPS細胞を培養可能であることが明らかになった。3. 中胚葉への分化誘導法の検討：赤血球は中胚葉組織に由来する。そのため、赤血球への分化誘導の第１ステップとして、中胚葉への分化誘導法を検討した。その結果、GSK3β阻害剤を培地に添加して1日培養することで、中胚葉マーカーであるTBXT遺伝子発現が、GSK3β阻害剤の濃度依存性に増加することが明らかになった。

iPS细胞具有多能性和自我更新能力，可以作为不依赖于献血者的稳定红细胞来源，有望解决输血血液短缺的问题。本研究的目的是通过基因组编辑建立红细胞标记报告基因犬iPS细胞系，并阐明利用犬iPS细胞产生红细胞的有效方法。迄今为止，已获得以下结果。 1.通过基因组编辑建立报告犬iPS细胞系：我们成功构建了携带红系谱系标记GYPA基因位点、两侧同源臂序列、Cas9基因和GFP基因的引导RNA的质粒载体。此外，通过将电穿孔制备的载体导入犬iPS细胞中，获得了细胞克隆，这表明已成功实现了目标基因位点的敲入。 2.犬iPS细胞培养条件的检查：为了从犬iPS细胞产生红细胞，提高犬iPS细胞培养条件的效率极其重要。因此，我们研究了市售的人类干细胞培养基和支架剂是否可以应用于犬iPS细胞培养。结果表明，通过将 StemFlex 或 mTeSR Plus 培养基与 Vitronectin 或 Geltrex 支架剂相结合，可以有效培养狗 iPS 细胞，而无需在周末更换培养基。 3.诱导分化为中胚层的方法的研究：红细胞源自中胚层组织。因此，作为诱导分化为红细胞的第一步，我们研究了诱导分化为中胚层的方法。结果表明，通过在培养基中添加GSK3β抑制剂并培养1天，中胚层标志物TBXT基因的表达以GSK3β抑制剂浓度依赖性方式增加。