マウス始原生殖細胞形成を制御する分子カスケードの解明

阐明控制小鼠原始生殖细胞形成的分子级联

基本信息

批准号：
15080213
负责人：
松居靖久
金额：
$ 82.3万
依托单位：
Tohoku University (2004-2007)Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、マウス始原生殖細胞の分化運命が決定される過程を制御する分子カスケードを明らかにし体細胞と生殖細胞の本質的な違いを最初に生み出す機構を解明することを目的とする。そのためこれまでに前駆細胞の時期から始原生殖細胞で特異的に発現するmil-1遺伝子を単離した。次に、この遺伝子の近傍領域にGFP遺伝子をつないだものでトランスジェニックマウスを作成し、始原生殖細胞での特異的な発現には、転写開始点から上流3kbpまでの領域が必要であることを明らかにした。これらの結果をふまえて本年度は、始原生殖細胞と胎仔生殖巣体細胞を用いて、この発現制御領域のDNAメチル化の差異をバイサルフェート法で調べ、始原生殖細胞ではほぼ完全に脱メチル化状態であるのに対して、体細胞では高メチル化状態になっていることがわかった。次にDNAのメチル化とmil-1遺伝子の発現制御との関連を明らかにするために、mil-1遺伝子を弱く発現している未分化ES細胞を、DNAを脱メチル化する作用のある5アザシチジン存在下で培養したところ、mil-1遺伝子の発現上昇と制御領域の脱メチル化が確認された。さらに発現制御領域にルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーターベクターをin vitroでメチル化したものと、脱メチル化状態のものをES細胞に導入し培養後にルシフェラーゼ活性を調べたところ、脱メチル化によりレポーター活性の上昇が見られた。これらの結果から、mil-1遺伝子の始原生殖細胞特的な発現制御には制御領域のDNAのメチル化が重要な役割を果たしていることが示唆された。

这项研究旨在阐明控制小鼠原始生殖细胞分化命运的过程，并阐明最初在体细胞和生殖细胞之间产生本质差异的机制。因此，在原始生殖细胞中特别表达的MIL-1基因已从祖细胞周期分离出来。接下来，我们使用连接到该基因附近区域的GFP基因创建了一种转基因小鼠，并揭示了原始生殖细胞中的特定表达需要一个从转录起始点到上游3 kbp的区域。考虑到今年这些结果，我们使用原始生殖细胞和胎儿性腺体细胞研究了该表达控制区域中DNA甲基化的差异，并发现虽然原始生殖细胞几乎完全脱甲基化，但它在体细胞中是高度甲基化的。接下来，为了阐明DNA甲基化与MIL-1基因表达对照之间的关系，在存在5azacytidine的情况下培养了弱表达MIL-1基因的未分化的ES细胞，该细胞具有脱硫DNA的作用，以及MIL-1基因的表达和调节区域的脱甲基化的表达。此外，当含有与表达控制区域的荧光素酶基因的报告载体在ES细胞中被甲基化并脱甲基化时，在培养后检查了荧光素酶活性。脱甲基化显示了报告基因活性的增加。这些结果表明，调节区域中DNA的甲基化在控制MIL-1基因在生殖细胞中的表达方面起着重要作用。