アクチン結合蛋白質コフィリンのストレス応答機構

肌动蛋白结合蛋白cofilin的应激反应机制

基本信息

批准号：
05268210
负责人：
西田栄介
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アクチン結合蛋白質コフィリンのアクチン結合様式の分子機構の解明のために、我々が同定したコフィリンのアクチン結合部位に相当する領域(12アミノ酸残基配列)の合成ペプチドを作製し、その合成ペプチドの解析を行った。その合成ペプチドは、アクチンと結合するとともにイノシトールリン脂質であるPIP2とも結合する。この合成ペプチドのNMRによる解析を行ったところ、このペプチド自体は溶液中で特定のコンフォメーションをとらないが、アクチンと結合するとある特定のコンフォメーションをとることがわかった。また、PIP2と結合した場合も同様の変化が起こること、アクチンとの結合様式とPIP2との結合様式は非常に似ていることなども明らかとなった。コフィリンはin vivoにおいてセリン残基がリン酸化されているが、そのリン酸化を担う蛋白質キナーゼを同定するために、大腸菌にコフィリンを発現させ、その組換えコフィリンを基質にして、細胞抽出液中にコフィリンリン酸化活性の検出を試みた。その結果、種々の細胞抽出液中に見かけ上のコフィリンキナーゼ活性が見い出された。大量に調整が可能なXenopus卵抽出液を用いて、分画・精製を進めようとしている。コフィリンの脱リン酸化を担うホスファターゼについては、キナーゼの同定後に行うつもりであったため、検索が行えなかった。今後、コフィリンキナーゼとコフィリンホスファターゼの同定を進め、両分子のストレス応答機構およびコフィリンのリン酸化、脱リン酸化による機能制御についてさらに解析を進める必要がある。

为了阐明肌动蛋白结合蛋白cofilin的肌动蛋白结合模式的分子机制，我们创建了与我们鉴定的肌动蛋白结合蛋白肌动蛋白结合位点对应的区域（12个氨基酸残基）的合成肽，并分析了合成肽去了。合成肽与肌动蛋白以及 PIP2（一种肌醇磷脂）结合。对这种合成肽的核磁共振分析表明，虽然肽本身在溶液中不呈现特定构象，但当它与肌动蛋白结合时，它呈现特定构象。还发现当它与PIP2结合时会发生类似的变化，并且与肌动蛋白和PIP2的结合模式非常相似。 cofilin的丝氨酸残基在体内被磷酸化，但为了鉴定负责磷酸化的蛋白激酶，我们在大肠杆菌中表达cofilin，使用重组cofilin作为底物，并将其添加到细胞提取物中，我们尝试检测cofilin。磷酸化活性。结果，在各种细胞提取物中发现了明显的丝动蛋白激酶活性。我们正在尝试使用爪蟾卵提取物进行分馏和纯化，这种提取物可以大量制备。我们无法寻找负责肌动蛋白丝切蛋白去磷酸化的磷酸酶，因为我们打算在鉴定激酶后这样做。未来有必要鉴定丝切蛋白激酶和丝切蛋白磷酸酶，并进一步分析这两种分子的应激反应机制及其通过丝切蛋白磷酸化和去磷酸化的功能调节。