Re-constitution of pre-RC complex

预 RC 复合体的重建

基本信息

批准号：
12470499
负责人：
MIZUSHIMA Tohru
金额：
$ 8.96万
依托单位：
OKAYAMA UNIVERSITY
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12470499/
关键词：
DNA Replication ORC ATP ADP ATPase Cdc6 ADP 活性調和 DnaA 酸性リン脂質機能ドメイン結晶構造解析

项目摘要

Origin Recognition Complex (ORC), a possible initiator of chromosomal DNA replication in eukaryotes, binds to ATP through its subunits Orc1p and Orc5p. Orc1p possesses ATPase activity. As for DnaA, the E. coli initiator, the ATP-DnaA complex is active but the ADP-DnaA complex is inactive for DNA replication and therefore, the ATPase activity of DnaA inactivates the ATP-DnaA complex tp suppress the re-initiation of chromosomal DNA replication. In this study, we investigated ADP-binding to ORC by a filter-binding assay. The K_d values for ADP-binding to wild-type ORC and to ORC-1A (ORC containing Orc1p with a defective Walker A motif) were less than 10 nM, showing that Orc5p can bind to ADP with a high affinity, similar to ATP. ORC-SA (ORC containing Orc5p with a defective Walker A motif) did not bind to ADP, suggesting that ADP-Orc1p complex is too unstable to be detected by the filter-binding assay. ADP dissociated more rapidly from wild-type ORC and ORC-1A than ATP did. Origin DNA fragments did not stimulate ADP-binding to any types of ORC. In the presence of ADP, ORC could not bind to origin DNA in a sequence-specific manner. Thus in eukaryotes, the ADP-ORC complex may be unable to initiate chromosomal DNA replication, and in this it resembles the ADP-DnaA complex in prokaryotes. However, overall control may be different. In eukaryotes, the ADP-ORC complex is unstable, suggesting that ADP-ORC complex might rapidly become ATP-ORC complex ; whereas in prokaryotes, ADP remains bound to DnaA, keeping DnaA inactive, and preventing re-initiation for some periods.

起源识别复合物 (ORC) 是真核生物中染色体 DNA 复制的可能启动子，通过其亚基 Orc1p 和 Orc5p 与 ATP 结合。 Orc1p 具有 ATP 酶活性。对于大肠杆菌引发剂 DnaA，ATP-DnaA 复合物具有活性，但 ADP-DnaA 复合物对 DNA 复制没有活性，因此，DnaA 的 ATPase 活性使 ATP-DnaA 复合物失活，从而抑制染色体复制的重新启动。 DNA复制。在这项研究中，我们通过过滤结合测定研究了 ADP 与 ORC 的结合。 ADP 与野生型 ORC 和 ORC-1A（含有具有缺陷 Walker A 基序的 Orc1p 的 ORC）结合的 K_d 值小于 10 nM，表明 Orc5p 可以以高亲和力与 ADP 结合，类似于 ATP。 ORC-SA（含有具有缺陷 Walker A 基序的 Orc5p 的 ORC）不与 ADP 结合，表明 ADP-Orc1p 复合物太不稳定，无法通过过滤结合测定法检测到。 ADP 与野生型 ORC 和 ORC-1A 的解离速度比 ATP 更快。原始 DNA 片段不会刺激 ADP 与任何类型的 ORC 结合。在 ADP 存在的情况下，ORC 无法以序列特异性方式与原始 DNA 结合。因此，在真核生物中，ADP-ORC复合物可能无法启动染色体DNA复制，在这一点上它类似于原核生物中的ADP-DnaA复合物。然而，总体控制可能会有所不同。在真核生物中，ADP-ORC复合物不稳定，表明ADP-ORC复合物可能迅速变成ATP-ORC复合物；而在原核生物中，ADP 仍然与 DnaA 结合，使 DnaA 保持不活跃，并在一段时间内防止重新启动。