腫瘍性タンパク質Skp2の量的制御を司る幹細胞腫瘍化抑制機構の包括的解析

全面解析癌蛋白Skp2定量调控的干细胞肿瘤发生抑制机制

基本信息

批准号：
17H06531
负责人：
清水康平
金额：
$ 1.75万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-08-25 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H06531/
关键词：
再生医療腫瘍化幹細胞タンパク質分解 Skp2

项目摘要

様々ながん組織において過剰発現を認め、幹細胞腫瘍化への寄与が示唆される腫瘍性タンパク質Skp2に関して、そのユビキチン-プロテアソーム系による量的制御を担うと考えられる上流のRING型E3ユビキチンリガーゼ(RING#BI)を同定し、RING#BI によるSkp2分解の腫瘍化抑制における役割について解析してきた。まず、RING#BIによるSkp2のユビキチン化に関する分子制御機構を明らかにするため、Skp2に対するRING#BIの結合領域の同定を試みた。欠失変異体を用いた解析より、RING#BIはSkp2のN末端領域で結合し、Skp2のユビキチン化・分解に必須の領域であることが明らかとなった。また、Skp2の既知上流E3として知られるCdh1はSkp2のD-boxを介してユビキチン化することが報告されているが、本課題においてRING#BIによるSkp2のユビキチン化にD-boxは不要であることが明らかとなった。この知見をもとに、RING#BIに特異的なSkp2の時間・空間的制御について検討を進めている。さらに、Skp2がRING#BIの生理的な基質であることを証明するにあたり、CRISPR-Cas9システムを用いてRING#BIのノックアウト細胞株を樹立し、Skp2及びSkp2の基質の発現量を検証した。その結果、RING#BIノックアウト細胞においてSkp2の発現量は上昇し、それに伴いSkp2基質の発現量が低下することを確認した。また、RING#BIノックアウト細胞は、DNAダメージによるアポトーシス誘導に抵抗性を示し、さらに、細胞増殖の促進が認められることから、細胞レベルにおいてRING#BIの腫瘍化抑制因子としての機能を見出すことができた。

已经在各种癌症组织中过表达的致癌蛋白SKP2已被鉴定出其对干细胞性肿瘤发生的贡献，已被鉴定出上游环形E3 E3泛素连接酶（RING＃BI），这被认为是造成泛素蛋白蛋白酶体系统的定量调控的造成泛素 - 抑制Ring＃ringgrrade n of Ring＃的作用的造成量的＃戒指＃bi。首先，为了阐明环＃BI泛素化SKP2的分子调节机制，我们试图识别Ring＃BI与SKP2的结合区域。使用缺失突变体的分析表明，环＃BI在SKP2的N末端区域结合，是SKP2泛素化和降解的重要区域。此外，据报道，通过SKP2的D-box被称为SKP2的已知上游E3上游E3的CDH1，但在这个主题中，D-box对于RIND＃BI泛素化不是SKP2的必要条件。基于这一发现，我们目前正在考虑对SKP2的时间和空间控制，这是针对Ring＃bi的。此外，为了证明SKP2是RING＃BI的生理底物，我们使用CRISPR-CAS9系统建立了RIND＃BI的基因敲除细胞系，并验证了SKP2和SKP2底物的表达水平。结果，已经证实，SKP2的表达水平在环＃BI基因敲除细胞中增加，并且SKP2底物的表达水平相应降低。此外，环＃BI基因敲除细胞对DNA损伤引起的凋亡具有抗性，并进一步促进了细胞增殖，从而使它们能够在细胞水平上找到作为致瘤性抑制剂的功能。