切断プロファイリング解析によるカスパーゼ依存シグナル伝達ネットワーク機構の解明

通过切割谱分析阐明 caspase 依赖性信号转导网络机制

基本信息

批准号：
11J10973
负责人：
清水康平
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

カスパーゼ(CASP)の活性化とそれに伴う基質切断は、主にアポトーシスの誘導・実行に関与する事が報告されてきたが、近年では細胞分化におけるシグナル伝達制御の重要な要素としても認識されてきた。本年度は、細胞分化におけるCASP依存シグナル伝達の役割の解明に向け、骨格筋分化をモデル系とし、分化誘導時にCASP3の活性化が確認されているマウス筋芽細胞株C2C12を利用して、本研究において同定してきたCASP3の基質キナーゼが筋分化に与える影響について検討した。筋分化後期に特異的に発現するミオシン重鎖の発現量増大を指標に、過剰発現解析によりスクリーニングした結果、Nek5が筋分化の促進に関与する可能性を見出した。さらに、定量的RT-PCRによる転写物発現解析により筋分化に伴いNek5の発現が上昇する事を明らかとし、この発現上昇をRNAiによりノックダウンすると筋分化が著しく抑制される事から、Nek5が筋分化の促進に寄与する事が明らかとなった。Nek5のCASP3による切断が筋分化制御に関与する可能性を考慮し、実際に筋分化過程の切断が観測されるか検証したところ、筋分化誘導に伴い活性化したCASP3によりNek5が切断される事が明らかとなった。そこで、切断の意義を検討するため、野生型Nek5、切断回避型点変異体、及び切断型変異体を用いて一過性過剰発現解析を行った結果、Nek5の切断は、Nek5が元来有するカスパーゼ活性化能を充進する事が明らかとなった。また、その結果、筋分化の促進に部分的に寄与するものの、細胞がより優先的にアポトーシスにコミットする確率を高めている事も明らかとなった。以上の結果から、Nek5はCASP活性を上方調節する事で効率的な筋分化環境を提供している可能性が示された。本成果は、動物においてこれまで性状が不明であったNek5の機能的役割を提示した初めての証拠である。

据报道，半胱天冬酶（CASP）的激活及其伴随的底物裂解主要参与细胞凋亡的诱导和执行，但近年来它也被认为是细胞分化过程中控制信号转导的重要元件。今年，为了阐明CASP依赖性信号转导在细胞分化中的作用，我们将以骨骼肌分化为模型系统，并使用小鼠成肌细胞系C2C12进行这项研究，其中CASP3在分化过程中被激活我们研究了 2009 年确定的 CASP3 底物激酶对肌肉分化的影响。以肌肉分化后期特异表达的肌球蛋白重链的表达量增加为指标，通过过表达分析进行筛选，结果发现Nek5可能参与促进肌肉分化。此外，使用定量 RT-PCR 进行的转录表达分析表明，Nek5 表达随着肌肉分化而增加，并且通过 RNAi 敲低这种增加的表达可以显着抑制肌肉分化，这一点已经明确，它有助于促进分化。考虑到CASP3对Nek5的裂解可能参与肌肉分化控制，我们验证了是否实际观察到了肌肉分化过程中的裂解，并发现Nek5被肌肉分化诱导后激活的CASP3裂解。因此，为了检查切割的意义，我们使用野生型Nek5、切割逃逸点突变体和截短突变体进行了瞬时过表达分析，结果表明它增强了激活caspase的能力。结果还表明，虽然它部分有助于促进肌肉分化，但它也增加了细胞优先发生凋亡的可能性。这些结果表明 Nek5 可能通过上调 CASP 活性来提供有效的肌肉分化环境。这一结果是显示 Nek5 功能作用的第一个证据，迄今为止，Nek5 在动物中的特性尚不清楚。