正常Bリンパ球由来iPS細胞を用いた多発性骨髄腫の腫瘍起源異常Bリンパ球の解明

使用源自正常 B 淋巴细胞的 iPS 细胞阐明源自多发性骨髓瘤肿瘤的异常 B 淋巴细胞

• 批准号: 16K18424
• 负责人: 川村 文彦
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K18424/
• 关键词: 再生医療; iPS細胞; Bリンパ球; 多発性骨髄腫; 造血幹細胞; 分化誘導; リプログラミング; 腫瘍化; がん幹細胞

多発性骨髄腫はBリンパ球において免疫グロブリンH(IgH)鎖遺伝子の位置する14番染色体とサイクリンD1など他の染色体の相互転座が腫瘍化原因とされる。しかしながら骨髄腫細胞は、Bリンパ球の分化段階で腫瘍化するB細胞リンパ種と多くの点で異なる。そこで我々は骨髄腫細胞の腫瘍化がB細胞の分化段階で起こるのではなく、分化が完了した成熟Bリンパ球または形質細胞のリプログラミングによる形質変化と染色体転座によって起こると推測した。これまで、IgH鎖遺伝子の再構成を認めるクローナルな正常Bリンパ球からiPS細胞を樹立した(BiPSCs)。このBiPSCsにTet-offシステムを用いて活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)を発現させるベクターを導入し、AIDの発現、ドキシサイクリンの添加によるAID発現消失をRT-PCR、免疫染色、ウェスタンブロッティングによって確認した(BiPSC-A)。またこのBiPSC-Aを造血幹細胞に分化誘導した。分化途中の任意な段階でのAIDの発現を、上記の方法によって確認した。分化開始からドキシサイクリンの添加が遅いほど、AIDの発現量が大きかった。現在、BiPSC-Aを免疫不全マウスに移植し、骨髄腫及びBリンパ系腫瘍の形成能を検証している。CRISPR Cas9システムを用いた染色体転座 t(11;14)を誘導するベクターを構築し、HEK293細胞に導入して11番染色体と14番染色体の転座を確認した。このベクターをBiPSCsに導入し、転座を誘導している。転座が確認されたBiPSCsを、BiPSC-Aと同様に免疫不全マウスの血管内及び精巣皮下に移植し、多発性骨髄腫またはBリンパ系腫瘍が発生するか検証する予定である。

据说多发性骨髓瘤是由免疫球蛋白 H (IgH) 链基因所在的 14 号染色体与 B 淋巴细胞中的细胞周期蛋白 D1 等其他染色体相互易位引起的。然而，骨髓瘤细胞在许多方面与 B 细胞淋巴瘤不同，后者在 B 淋巴细胞分化阶段发展成肿瘤。因此，我们推测骨髓瘤细胞的肿瘤发生并非发生在B细胞分化阶段，而是通过已完成分化的成熟B淋巴细胞或浆细胞的重编程导致的染色体易位和表型变化而发生。到目前为止，我们已经从具有重排 IgH 链基因的克隆正常 B 淋巴细胞中建立了 iPS 细胞 (BiPSC)。使用Tet-off系统将表达活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的载体引入这些BiPSC中，并通过RT-PCR、免疫染色、和蛋白质印迹（BiPSC-A）。此外，该BiPSC-A被诱导分化为造血干细胞。通过上述方法确认了分化过程中任意阶段的AID表达。从分化开始开始越晚添加多西环素，AID的表达水平越高。我们目前正在将 BiPSC-A 移植到免疫缺陷小鼠体内，并验证其形成骨髓瘤和 B 淋巴肿瘤的能力。我们利用CRISPR Cas9系统构建了诱导染色体易位t(11;14)的载体，将其导入HEK293细胞中，并证实了11号和14号染色体的易位。将该载体引入 BiPSC 中以诱导易位。已确认易位的BiPSC将以与BiPSC-A相同的方式通过血管内和皮下移植到免疫缺陷小鼠的睾丸中，我们计划验证是否会发展为多发性骨髓瘤或B淋巴肿瘤。

项目成果

Establishment of iPSCs from B lymphocytes and AID expression in their hematopoietic stem cells

B 淋巴细胞 iPSC 的建立及其造血干细胞中 AID 的表达

• 发表时间: 2017
• 作者: 川村 文彦;稲木 誠;片渕 淳;阿部 悠;津山 尚宏;黒須 由美子;柳 亜希;樋口 光徳;武藤 哲史;山浦 匠;鈴木 弘行;野地 秀義;鈴木 眞一;吉田 光明;笹谷 めぐみ;神谷 研二;小野寺 雅史;坂井 晃
• 通讯作者: 坂井 晃