甲状腺刺激ホルモン受容体の分子生物学的解析

促甲状腺激素受体的分子生物学分析

基本信息

批准号：
06671024
负责人：
小杉眞司
金额：
--
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

甲状腺刺激ホルモン(TSH)受容体の細胞膜貫通領域をsite-directed mutagenesisにより変異させ、Cos-7細胞にトランスフェクションして表現実験を行い、非刺激下、TSH・TSAb(バセドウ病甲状腺刺激抗体)刺激下でのcAMP・イノシトール燐酸産生能とTSH結合能の測定およびTSH受容体の一部の合成ペプチドに対する特異抗体を用いたウエスタンブロットによる受容体蛋白の確認を各変異体についておこなった。その結果、第2細胞内ループの中央部(アミノ酸残基525-527;メチオノニンスタート部位を1とした番号)がGsとの相互作用に重要であることが明かとなった。また、Gqとの相互作用については以前報告していた第3細胞内ループの他、第1細胞内ループ全体、第2細胞内ループ、細胞内末尾部のN末側と広く分布していることを明かとした。さらに、細胞外ループについても同様の検討を行い、第3細胞外ループもcAMP系とイノシトール燐酸系の両方のシグナル伝達に重要であることを明かとした。プランマー病に見いだされたTSH受容体の第6細胞膜貫通ヘリックス部の4種類の点変異がいずれも刺激無しで活性化されている、いわゆるconstitutive activationを起こすものであることを表現実験によって示し、疾患の直接の原因となっていることを証明した。また、糖付加部位のミュータジェネシスにより、TSH受容体のアスパラギンリンクの糖鎖には種差があることを明かとした。

通过定分诱变将甲状腺刺激激素（TSH）受体的跨膜区域突变，并转染到COS-7细胞中以表达表达实验。在刺激TSH和TSAB（Graves疾病甲状腺刺激性抗体）下，对突变体进行了产生cAMP和肌醇磷酸盐和TSH结合的能力的测量，并通过使用特定的抗体对TSH受体的合成肽进行特定的抗体，通过蛋白质印迹证实了受体蛋白。结果，据揭示了第二个细胞内环的中心部分（氨基酸残基525-527;具有蛋氨酸启动位点1的数量）对于与GS的相互作用很重要。此外，还表明与GQ相互作用在整个第一个细胞内环，第二个细胞内环和细胞尾端的N末端侧的相互作用除外，除了第三个细胞内环外，在先前的报告中。此外，在细胞外环上进行了类似的研究，表明第三个细胞外环对于在cAMP系统和肌醇磷酸盐系统中发出信号很重要。实验表明，在Plummer病中发现的TSH受体的第六个跨膜螺旋段中的所有四个点突变均未激活而无需刺激，引起所谓的本构激活，并证明它们是疾病的直接原因。此外，揭示了由于糖基化部位的诱变，TSH受体的天冬酰胺连接的糖链中存在物种差异。