サブトラクション/エクスプレッション法を用いた顆粒球機能分子の同走

使用减法/表达法同时移动粒细胞功能分子

• 批准号: 06670480
• 负责人: 本田 善一郎
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670480/
• 关键词: 顆粒分泌; カルシウムシグナル; Gq; IP3受容体; ダウンレギュレーション

本研究の目的はアフリカツメガエル卵母細胞の遺伝子発現システムとハイブリッドサブトラクションの二つのシステムを組み合わせて、炎症細胞活性化一顆粒放出を正、あるいは負に制御する未知の細胞内機能分子を探索することである。本年度はまず1)モデル受容体(血小板活性因子受容体)およびマスト細胞mRNAを卵母細胞に共発現させ、顆粒分泌の再構成システムを作成すること、2)すでにクローン化された機能素子をさらに共発現させて活性化の正負の制御をモニターしこのシステムの妥当性を確認すること、を行った。1)種々の機能的なアッセイ法をもちいて、シメガエル卵母細胞にcRNA,組織mRNAを安定に共発現できることを確認し、システムの最適化に成功した。マスト細胞株mRNAを発現させると10ng/卵母細胞のヒスタミンが合成され、顆粒分泌を通常のヒスタミン自動シール装置分析装置で測定できることが確認された(未発表)。2)さらに共発現させる遺伝子として情報変換分子であるGqおよびその変異体を作成して卵母細胞に発現させ、モデル受容体からのカルシウムシグナリング-分泌反応を測定し、同分子による正負の制御を検討した。検討の結果、Gq活性型分子(Watanabe,Waga,Honda et al.J.Biol.Chem.in press)はモデル受容体からのカルシウムシグナリング-分泌反応を完全に抑制し、その主たる機序はkey moleculeの一つであるIP3受容体のdown-regulationであることを発見した(Honda,et al.J.Biol.Chem.inpress)。この新しい知見はシステムの妥当性を確認すると共に、受容体脱感作、細胞のアネルギーの理解を深めることとなった。

这项研究的目的是将非洲爪蟾卵母细胞基因表达系统和混合减法这两个系统结合起来，探索正向或负向调节激活炎症细胞的颗粒释放的未知细胞内功能分子。今年，我们将首先1）通过在卵母细胞中共表达模型受体（血小板激活因子受体）和肥大细胞mRNA来创建重建的颗粒分泌系统，以及2）进一步开发已经克隆的功能元件。通过共同表达该系统并监测激活的正负控制来验证该系统的有效性。 1）利用各种功能测定方法，我们证实cRNA和组织mRNA可以在非洲爪蟾卵母细胞中稳定共表达，并成功优化了系统。证实当肥大细胞系mRNA表达时，合成10ng/卵母细胞的组胺，并且可以使用常规组胺自动密封分析仪(未公开)测量颗粒分泌。 2）此外，我们创建了信息转导分子Gq及其突变体作为共表达基因，在卵母细胞中表达它们，测量模型受体的钙信号分泌反应，并确定同一分子I的正向和负向调节。考虑了一下。研究结果表明，Gq激活分子（Watanabe、Waga、Honda等人，J. Biol. Chem.，待出版）完全抑制了模型受体的钙信号传导-分泌反应，其主要机制是关键分子发现它下调了 IP3 受体（受体之一）（Honda 等人 J. Biol. Chem. inpress）。这一新发现证实了该系统的有效性，并加深了我们对受体脱敏和细胞无反应性的理解。

项目成果

和賀,中村,本田,他: "Two distinct signal transduction pathways for the activation of guinea pig macrophages and neutrophilss by endotosin" Biochem.Biophys.Res.Comnum.197. 465-472 (1994)

Waga、Nakamura、Honda 等人：“内毒素激活豚鼠巨噬细胞和中性粒细胞的两种不同信号转导途径”Biochem.Biophys.Res.Comnum.197（1994）。

高野,本田,他: "Role of cyteeplamic tail phosphorylation site of platelet-actiuating factor reseptor in agomist-induced desensitigation" The Journal of Biological chemistry. 269. 12722-12730 (1994)

Takano, Honda 等人：“血小板激活因子受体的细胞质尾部磷酸化位点在激动剂诱导的脱敏中的作用”《生物化学杂志》269。12722-12730 (1994)。

尾藤,本田,他: "Cloning,expression,and tissue distsibution of rat platalet-activating factor receptor eDNA." Europian Journal of Biochemistry. 221. 211-218 (1994)

Bito, Honda 等人：“大鼠血小板激活因子受体 eDNA 的克隆、表达和组织分布。”欧洲生物化学杂志 221. 211-218 (1994)

渡辺,和賀,本田 他。: "Prostaglaudin F2α stimulates formation of the p21^<ras>-GTP conplex and mitogen-activated protein kinase activity in NIH-3T3 cells." The Journal of Biological chemistry. (in press). (1995)

渡边、和贺、本田等人。

本田 他: "Transfected platalet-activatingfactor receptor activates mitogen-activated protein (MAP)kinase and MAPKinase kinase" The Journal of Biological chemistry. 269. 2307-2315 (1994)

Honda 等人：“转染的血小板激活因子受体激活丝裂原激活蛋白 (MAP) 激酶和 MAPK 激酶”《生物化学杂志》269. 2307-2315 (1994)。