ミトコンドリアDNA塩基配列から見た日本産肺吸虫属内の分子系統類縁関係

从线粒体 DNA 序列观察日本肺吸虫属内的分子系统发育关系

基本信息

批准号：
06670261
负责人：
吾妻健
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670261/
关键词：
ミトコンドリアDNA PCR 塩基配列肺吸虫系統樹

项目摘要

日本産肺吸虫類の系統類縁関係については、まだ不明な点が多い。本研究では、進化の速度が速く、しかも母性遺伝する、ミトコンドリアDNAの塩基配列を用いて、可能な日本産肺吸虫の系統樹の作成を試みた。今回使用した種類は、ウエステルマン肺吸虫(対馬産:3倍体)、宮崎肺吸虫(南国産)、大平肺吸虫(城崎産)、佐渡肺吸虫(佐渡産)の4種である。まず、各サンプルは、TEバッファーでホモジナイズし、フェノール/クロロフォルムで2回、クロロフォルムで1回処理した後、エタノール沈殿により、DNAを回収した。回収したDNAはテンプレートとして、PCRを行なった。プライマーは、5′-TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT T-3′及び5′-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA AT-3′である。PCRの条件は、95℃ 1分、50℃ 1分、72℃ 3分、30サイクルである。増幅したDNA断片はチトクロームCオキシダーゼサブユニットI(COI)領域の395ベースペアである。各増幅断片はpGem系のTAベクターにクローニングし、各種ごとに3クローンづつシーケンスを行なった。シーケンスは、ABIのダイプライマー法を用いて、ABI 373Aオートシーケンサーにより行なった。系統樹の作成は、Paupの最大節約法及びClustal Vの近隣接合法を用いて行なった。その結果、2つの異なる方法とも同じ結論に達した。即ち、大平肺吸虫と佐渡肺吸虫が一つのクラスターを形成し、次に宮崎肺吸虫がそのクラスターといっしょになり、ウエステルマン肺吸虫は、一番離れたグループであることが分かった。この結果はアイソザイム分析の結果と一致した。

关于日本肺漏斗的系统发育关联，仍然有许多未知数。在这项研究中，我们试图使用线粒体DNA的碱基序列创建可能的日本肺泡的系统发育树，该树正在迅速发展和母体遗传。这次使用的四种类型是韦斯特曼肺燕子（Tsushima：三倍体），宫崎肺燕子（热带），ohira肺燕子（Kirosaki）和Sado肺燕子（Sado）。首先，将每个样品用TE缓冲液匀浆，用苯酚/氯仿处理两次，一次用氯仿处理，然后通过乙醇沉淀收集DNA。恢复的DNA用作模板，并执行PCR。引物为5'-TTT TTT GGG CAT CCT GAG GTT T-3'和5'-TAA AGA AAG AAC AAC ATA ATA atg AAA AT-3'。 PCR条件在95°C下为30个循环1分钟，50°C 1分钟，72°C持续3分钟。放大的DNA片段是细胞色素C氧化酶亚基I（COI）区域的395碱基对。将每个扩增的片段克隆到基于PGEM的TA载体中，并在每个片段中在三个克隆中进行测序。使用ABI的Die Primer方法使用ABI 373A自动Quencer进行测序。系统发育树是使用PAUP的最大保存方法和Clustal V的相邻方法创建的。因此，这两种不同的方法得出了相同的结论。也就是说，ohira和Sado肺洪水形成了一个集群，其次是宫崎骏肺洪水与该集群，而Westerman肺洪水被发现是遥远的群体。该结果与同工酶分析的结果一致。