PCR法を用いたDNA塩基配列レベルでのウェステルマン肺吸虫2倍体と3倍体の異同

使用PCR方法在DNA序列水平上观察二倍体和三倍体韦氏肺吸虫的差异

基本信息

批准号：
05670228
负责人：
吾妻健
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kochi Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670228/
关键词：
ミトコンドリアDNA PCR RFLP ウェステルマン肺吸虫 3倍体

项目摘要

ウエステルマン肺吸虫の材料は、2倍体は大分、兵庫、三重、千葉の4地域から、3倍体は対馬、天草、屋久島の3地域からそれぞれメタセルカリアの感染したサワガニやモクズガニを採集し、犬及び猫に感染させ150日前後に成熟成虫を回収した。まず制限酵素切断パターンの解析を行なった。回収した成虫は一匹ごとにリン酸緩衝液にてホモジナイズしTamura & Aotsuka(1988)の方法にしたがってミトコンドリアDNAを分離した。分離されたミトコンドリアDNAは、エチジウムブロマイド染色(アガロースゲル電気泳動)や銀染色(アクリルアミドゲル電気泳動)で識別するのに十分に精製されていた。今回用いた制限酵素は6塩基対cutterではAccI,ApaI,BgIII,EcoRV,HincII,PstI,pvuII,SacI,SmaI,SphI,XbaIの11種類、4塩基対ではHaeIII,HinfI,MspI.RsaIの4種類である。サザーンブロッティングハイブリダイゼーションではdigoxigeninでラベルされたUTPの取り込みを利用した方法を用いてプローブを作成した。その結果、多型現象は6base cutterではほとんど認められなかったが4base cutterでは集団内外に観察された。しかしその程度はかなり低いものであった。3つの制限酵素(PstI,HaeIII,RsaI)の切断パターンにおいて、2倍体と3倍体が異なることを見い出した。特にPstIでは、どの2倍体も唯一のcutting site(一本のバンド)を有するのに対して3倍体はどの個体も常に2箇所のcutting site(2本のバンド)を持つことが分かった。4base cutter のHaeIIIとRsaIでは、多数のバンドが得られたが、その中の一部のバンドが倍数性に特有なパターンを示し、両者を分けることができた。一方ミトコンドリアDNAのチトクロームcオキシダーゼサブユニットI(COI)の一部の領域をPCR法を用いて増幅しpGEMベクターにクローニングした。これをABIのシーケンサー373A型により塩基配列を決定し比較したところ、この領域では違いは認められなかった。以上の結果より、日本産ウエステルマン肺吸虫の3倍体は日本産の2倍体とはミトコンドリアDNAの制限酵素切断パターンのレベルでも異なっていることが分かり我々の雑種起源説を支持する結論に達した。

Westermann的肺fluke是从二倍体的四个区域收集的：OITA，HYOGO，MIE和CHIBA，分别是从三个区域的三个区域，分别从三个区域：Tsushima，Amakusa和Yakushima，以及三个区域，三个区域：MetaCercariae Infected of Metacercariae Infected tocted toclected围绕狗和猫摄制了15天，并受到了15天的收集。首先，分析了限制酶裂解模式。将回收的成年人在每种动物的磷酸盐缓冲溶液中均匀，并根据Tamura＆Aotsuka（1988）的方法分离线粒体DNA。分离的线粒体DNA被充分纯化，可通过溴化乙锭染色（琼脂糖凝胶电泳）和银染色（丙烯酰胺凝胶电泳）鉴定。在这种情况下，六个基对切割机使用11种类型的限制酶：ACCI，APAI，BGIII，ECORV，HINCII，PSTI，PSTI，PVUII，SACI，SACI，SMAI，SMAI，SPHI和XBAI和4个基本对：Haeiii，Hinfi，Mspi.rsai。使用一种在Southern印迹杂交中使用二氧素标记的UTP掺入的方法创建探针。结果，在6个刀具中很少观察到多态性，但在人口内外的4个键切割器中都观察到了多态性。但是，这个水平很低。我们发现，二倍体和三倍体在三种限制酶（PSTI，HAEIII和RSAI）的裂解模式上有所不同。特别是，在PSTI中，发现每个二倍体只有一个切割位点（一个带），而每个三倍体始终都有两个切割位点。在4个键切割器中获得了HAEIII和RSAI的大量频段，其中一些表现出斑点独特的模式，从而使它们分开。另一方面，使用PCR方法扩增了线粒体DNA的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）的部分区域，并克隆到PGEM载体中。当使用ABI Sequencer型373A确定基本序列时，该区域未观察到差异。从以上结果来看，我们发现日本韦斯特曼的肺fl幸的三倍体与线粒体DNA的限制酶裂解模式的级别不同，我们得出了一个支持我们混合杂交原产理论的结论。