ヒトNADH-シトクロムb_5還元酵素の電子伝達の分子機構

人NADH-细胞色素b_5还原酶电子转移的分子机制

基本信息

批准号：
06670150
负责人：
調恒明
金额：
$ 1.28万
依托单位：
大分医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに、摂南大学・高野らとの共同研究によりヒトNADH-シトクロムb_5還元酵素の3次構造を明らかにした。この結果から、本酵素の94番目のThrが補酵素FADのイソアロキサジン環のN5原子から約3A^^○の距離にあることが示された。そこで本研究では、既に確立していた本酵素の大腸菌における大量発現系をもとに、部位特異的変異法によりThr-94を種々のアミノ酸残基に置き換えた変異酵素を作製し、その酵素学的パラメータを測定することにより、本残基の反応における役割を明らかにすることによって反応機構の本質を理解することを目的としている。これまでにThe-94をSer,Ala,Cys,Asnに置換した発現プラスミドを作製したが、Thr-94→Alaの変異では活性をほとんど検出できず、本残基は酵素活性に必須であると考えられた。Thr-94→Serの活性は野生型とほぼ同程度で、94番目にOH基があることが重要であると考えられた。Thr-94→Asnの変異では、活性が約0.2%に低下していたが、stopped flow法で測定した還元半反応は、野生型と同程度の速度を保っており酸化半反応速度が特異的に遅くなっていると考えられた。これらの結果からThr-94は反応に極めて重要であると結論した。現在これらの変異酵素の3次構造を解析すべく、大量精製、結晶化を行なっている。

到目前为止，与Takano的Sengnan大学的合作揭示了人类NADH-CYTOCHROME B_5还原酶的第三级结构。这些结果表明，该酶的第94次THR大约为3A ^^○从辅酶FAD的异醛嗪环的N5原子中。因此，本研究旨在通过创建突变酶来理解反应机制的本质，其中使用位置定向的突变方法将THR-94替换为各种氨基酸残基，并通过测量这些残基的酶促参数，目的是阐明该残基在反应中的作用，并阐明反应作用。已经制备了SER，ALA，CYS和ASN代替-94的表达质粒，但在THR-94→ALA突变中无法检测到活性，并且该残基被认为对酶活性是必不可少的。 THR-94→SER的活性与野生型的活性大致相同，并且认为在第94位拥有OH组很重要。 THR-94→ASN突变的活性降低到约0.2％，但是通过停止流量方法测量的还原半反应的速度与野生型突变的速率相似，并且认为氧化半反应动力学被认为是特异性较慢的。这些结果得出结论，THR-94对于反应非常重要。当前，正在进行大量的纯化和结晶，以分析这些突变酶的三级结构。