機能的劣性遺伝子単離を目指した新規スクリーニング法の開発

开发旨在分离功能性隐性基因的新筛选方法

• 批准号: 14657083
• 负责人: 黒崎 知博
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657083/
• 关键词: DT40; 相同組み換え; 劣性遺伝子; スクリーニング法

哺乳類細胞の場合、劣性遺伝子を単離したい時、多くの遺伝子がdiploidで存在することが障害になる。このため、既にchicken chromosomeのcetromere,telomere周辺の遺伝子配列は決定されているので、相同組換えを利用してある特定のchromosome(chickenには5本存在する)の長腕、短腕を、特異的にdeletionすることが可能である。従って先ず、この方法を用いて部分的haploid DT40 B細胞を作成することを試みた。chicken常染色体は5本からなっており、その4番染色体と5番染色体は種々の遺伝子座位が詳細に決定されている。従ってこの染色体をモデルにcentromere,telomere近傍の遺伝子座位を組替え領域に用いて大きな遺伝子deletion targeting vectorを構築した。Targeting vectorをDT40細胞にtransfectionして、targettingが生じたかをSouthern blottingにより検定した。4番、5番とも短腕のdeletionは比較的容易に単離することができたが、いずれも長腕の場合は頻度は低かった。このことは、長腕の場合はdeletionする領域が長いため、又は、クロマチン等構造的に相同組換えを生じる酵素系がaccessしづらいためではないかと考えられる。

在哺乳动物细胞中，许多基因以二倍体形式存在这一事实在分离隐性基因时造成了障碍。为此，由于鸡染色体的丝粒和端粒周围的基因序列已经确定，因此可以利用同源重组来创建某条染色体的特定长臂和短臂（鸡中有5个）。手动删除该文件。因此，我们首先尝试使用这种方法生成部分单倍体 DT40 B 细胞。鸡常染色体由5条染色体组成，4号和5号染色体上的各个基因位点已被详细确定。因此，以该染色体为模型，以着丝粒和端粒附近的基因位点作为重组区域，构建了大型基因缺失靶向载体。将靶向载体转染DT40细胞，通过Southern印迹检测是否发生靶向。 4号和5号的短臂缺失相对容易分离，但长臂的缺失不太频繁。这被认为是因为在长臂的情况下要删除的区域很长，或者因为引起同源重组的酶系统难以在结构上接近如染色质。

项目成果

Kurosaki, T.: "Regulation of B cell fates by BCR signaling components"Curr. Opin. Immunol.. 14. 341-347 (2002)

Kurosaki, T.：“BCR 信号成分调节 B 细胞命运”Curr。

Kurosaki, T.: "Regulation of B-cell signal transduction by adaptor proteins"Nature Rev. Immunol.. 2. 354-363 (2002)

Kurosaki，T.：“衔接蛋白对 B 细胞信号转导的调节”Nature Rev.Immunol.. 2. 354-363 (2002)

Kurosaki, T.: "Checks and balances on developing B cells"Nature Immunol.. 4. 13-15 (2003)

Kurosaki, T.：“检查和平衡发育中的 B 细胞”《自然免疫学》4. 13-15 (2003)