細胞表層を反応場としたタンパク質間相互作用解析系の構築

以细胞表面为反应场的蛋白质-蛋白质相互作用分析系统的构建

基本信息

批准号：
21K05130
负责人：
末田慎二
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyushu Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、培養細胞の表層を反応場として利用したタンパク質間相互作用解析系を構築することを目的としている。具体的にはターゲットとなる標的タンパク質を、膜タンパク質を介して培養細胞の表層に発現させ、そこに蛍光ラベル化したもう一方のタンパク質を添加して、両者の相互作用を蛍光イメージングにより解析する系の構築を目指している。今年度は、タンパク質間相互作用のモデル系として、Rapamycin（抗生物質）によって結合が促進されることがよく知られている、FKBP12とFRB間の相互作用を利用して解析系の構築を行った。ここでは FKBP12 を細胞表層に提示し、GFPでラベル化したFRB（GFP-FRB）を添加して評価を行った。その結果、膜タンパク質とFKBP12の融合タンパク質を発現させた細胞に、Rapamycinと共にGFP-FRBを添加したところ、細胞表層からGFPに由来する蛍光を顕著に観察することができた。一方でRapamycin非共存下では細胞表層からの顕著な結合は観察できなかったため、本系を利用してFKBP12とFRB間の特異的な結合をモニターできることがわかった。しかしながら、細胞が存在しない培養ディッシュ表面へのGFP-FRBの非特異的な結合が予想以上に起こることがわかったため、ディッシュ表面のコーティング方法を検討した。その結果、コラーゲンコーティングを行うことにより、ある程度GFP-FRBの非特異的な結合を抑えることができることがわかった。また今年度は上記の検討と共に、細胞表層に提示させる標的タンパク質のN末端にタグを連結して、そのタグを利用してN末端部位が細胞表層に提示されていることを確認できる系の構築を行った。具体的には、FKBP12と膜タンパク質の融合タンパク質のN末端にタグとしてBCCPを連結させた発現系を構築した。

本研究的目的是构建一个利用培养细胞表层作为反应场的蛋白质-蛋白质相互作用分析系统。具体来说，我们的目标是构建一个系统，其中目标蛋白通过膜蛋白在培养细胞的表面层表达，另一种荧光标记蛋白添加到其中，并使用荧光成像分析两者之间的相互作用。今年，作为蛋白质-蛋白质相互作用的模型系统，我们利用 FKBP12 和 FRB 之间的相互作用构建了一个分析系统，众所周知，这种相互作用是由雷帕霉素（一种抗生素）促进的。此处，将 FKBP12 呈现在细胞表面，并添加 GFP 标记的 FRB (GFP-FRB) 进行评估。结果，当将GFP-FRB与雷帕霉素一起添加至表达膜蛋白和FKBP12的融合蛋白的细胞时，可以从细胞表面清楚地观察到源自GFP的荧光。另一方面，在没有雷帕霉素的情况下，没有观察到细胞表面的显着结合，表明该系统可用于监测 FKBP12 和 FRB 之间的特异性结合。然而，我们发现 GFP-FRB 与没有细胞的培养皿表面的非特异性结合发生的频率比预期要高，因此我们研究了一种涂覆培养皿表面的方法。结果发现，胶原涂层可以在一定程度上抑制GFP-FRB的非特异性结合。除了上述研究之外，本财年我们将构建一个系统，将标签连接到要显示在细胞表面上的目标蛋白的 N 末端，并使用该标签来确认 N 末端部分是显示在细胞表面。具体来说，我们构建了一个表达系统，其中BCCP作为标签连接到FKBP12和膜蛋白的融合蛋白的N末端。