機能的劣性遺伝子単離の新規方法論の開発

开发功能性隐性基因分离的新方法

基本信息

批准号：
19659124
负责人：
黒崎知博
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19659124/
关键词：
劣勢遺伝子 DT40 Cre tamoxifen flox

项目摘要

哺乳類細胞の場合、劣性遺伝子を単離したい時、多くの遺伝子がdiploidで存在することが障害になる。このことが、新規シグナル分子の単離を拒んでいる大きな原因の一つである。そこで、私たちは相同組み換えの頻度が非常に高いchikenDT40細胞の特性を最大限用いて、劣性遺伝子の単離を試みている。先ず、その第一歩としてDT40細胞の部分的haploid細胞の樹立を試みている。この目的のため、既に、chickenDT40細胞において、chromosomeのcentromere,telemere周辺の遺伝子配列は決定されているので、相同組換えを利用して、ある特定のchromosome(chickenには5本存在する)の長腕、短腕を特異的にdeletionすることが可能になる。しかしながらhaploid遺伝子の場合、目的とする遺伝子が細胞の生存に必須である場合、この遺伝子の単離は困難を極めることになる。従って本年は、この生存に必須の遺伝子群単離を目的としてtamoxifen存在下で遺伝子をdeletionできるよう、Cre-ER融合遺伝子を発現させたDT40細胞を樹立した。Cre-ERを発現した細胞では、flox siteを導入した遺伝子がtamoxifen存在下で初めてdeletionされ、この方法が有効であることを確認した。又、細胞生存を増強すると考えられている遺伝子Bc12をDT40細胞に強制発現することにより、たとえ特定の遺伝子が生存に必須であってもrescue可能なような細胞を樹立した。

在哺乳动物细胞中，许多基因以二倍体形式存在这一事实在分离隐性基因时造成了障碍。这是新信号分子分离受到抵制的主要原因之一。因此，我们试图充分利用chikenDT40细胞同源重组频率非常高的特性来分离隐性基因。首先，作为第一步，我们尝试建立部分单倍体 DT40 细胞。为此，在鸡DT40细胞中，染色体着丝粒和端粒周围的基因序列已经确定，因此我们可以利用同源重组来延长特定染色体（其中鸡中有5条），从而使特异性删除成为可能。手臂和短臂。然而，就单倍体基因而言，如果感兴趣的基因对于细胞生存至关重要，那么分离该基因是极其困难的。因此，今年，为了分离生存必需的基因，我们建立了表达Cre-ER融合基因的DT40细胞，以便在他莫昔芬存在的情况下删除这些基因。在表达 Cre-ER 的细胞中，引入 flox 位点的基因首先在他莫昔芬存在的情况下被删除，证实了该方法的有效性。此外，通过在DT40细胞中强制表达Bc12基因（被认为可以增强细胞存活率），我们建立了即使特定基因对于生存至关重要也可以被拯救的细胞。