新規シグナル分子単離を目指した遺伝学的スクリーニング法の開発

开发用于分离新信号分子的遗传筛选方法

基本信息

批准号：
15659118
负责人：
黒崎知博
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659118/
关键词：
劣性遺伝子 DT40 変異アッセイ系 GFP遺伝子ノックイン

项目摘要

哺乳類細胞の場合、劣性遺伝子を単離したい時、多くの遺伝子がdiploidで存在することが障害になる。このため、既にchickenDT40細胞において、chromosomeのcetromere,telemere周辺の遺伝子配列は決定されているので、相同組換えを利用してある特定のchromosome(chickenには5本存在する)の長腕、短腕を特異的にdeletionすることが可能である。既にこの方法を用いてchickenに存在するchromosomeの1、2、3のdeletion作成した。次にchromosome dessectionにより、1、2、3のchromosomeのgenomic bank (約20-50kb/clone)をつくり、その際in vitroで化学変異源を用いそれぞれのgenomic cloneに変異をいれると同時に哺乳類薬剤markerであるneo遺伝子を導入した。一方、DT40細胞のアッセイ系をGFPで光学的に容易に検出できるようシステムを構築した。Bcl-2遺伝子は、NF-KB径路により強く制御されているので、Bcl-2遺伝子プロモーター領域にGFP遺伝子をノックインの方法を用いて導入した。実際、NF-KB径路を活性化するシグナルをこの細胞に加えるとGFPの顕著な上昇が認められ、システムとして用いることができることを判明した。又、このBcl-2/GFPを導入したDT40細胞を用いて、変異を導入し、かつneo遺伝子を導入したgenomic bankをトランスフェクションして約1000個のクローンを得た。

在哺乳动物细胞中，许多基因以二倍体形式存在这一事实在分离隐性基因时造成了障碍。因此，由于鸡DT40细胞中染色体的丝粒和端粒周围的基因序列已经确定，因此可以利用同源重组来识别特定染色体的长臂和短臂（鸡有5条）。专门删除。我已经使用这种方法在鸡中删除了 1、2 和 3 号染色体。接下来，通过染色体解剖创建染色体 1、2 和 3 的基因组库（大约 20-50 kb/克隆），此时，使用体外化学诱变剂将突变引入每个基因组克隆中，并在同时，我们引入了哺乳动物药物标记。另一方面，我们构建了 DT40 细胞测定系统，可以使用 GFP 轻松进行光学检测。由于Bcl-2基因受到NF-KB途径的强烈调控，因此采用敲入方法将GFP基因引入Bcl-2基因启动子区域。事实上，当将激活 NF-KB 通路的信号添加到这些细胞中时，观察到 GFP 显着增加，表明它可以用作一个系统。此外，使用该导入了Bcl-2/GFP的DT40细胞，转染已导入突变且已导入neo基因的基因组库，以获得约1000个克隆。