ヒト老化マーカータンパクSMP30の年齢推定への応用

人类衰老标志蛋白SMP30在年龄估计中的应用

基本信息

批准号：
07670501
负责人：
木村章彦
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Wakayama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670501/
关键词：
SMP30 老化モノクローナル抗体年齢推定

项目摘要

ラット肝のホモジネイトから硫安分画、蔗糖濃度勾配IEF、ゲル濾過後、二次元電気泳動によりラットSMP30を、SDS-PAGEにおいてほぼ単一なバンドとして精製することができた。このラットSMP30を抗原として、ウサギに免疫し、ラットSMP30に対する十分な力価を有する抗血清を得、ハイドロキシアパタイトカラムにより精製してIgG画分とした。このIgG画分をホルミルセルロファインにカップリングしアフィニティーゲルを作製した。剖検時に採取したヒト肝のホモジネイトの硫安分画をこのアフィニティーカラムにかけ、その結合画分よりヒトSMP30をほぼ単一に精製した。ここで得られたヒトSMP30を抗原としてマウスに足底免疫し、モノクローナル抗体の作製を行ったが、十分な特異性と安定性を有するクローンを得ることはできなかった。そこで、免疫法を腹腔免疫に変更して再度モノクローナル抗体の作製を行ったが、足底免疫とほぼ同様の結果に終わった。これは、精製ヒトSMP30中に微量に存在する夾雑物の免疫原性が高く、ヒトSMP30に対するクローンの活性化を妨げるためと考えられる。そこで現在、今回抗原として用いたヒトSMP30をIEFおよび二次元電気泳動により更に精製を進め、これを抗原としてモノクローナル抗体の作製を行っており、まもなくヒトSMP30に対するモノクローナル抗体が得られるものと思われる。今後、引き続き本研究の最終的目的であるヒトにおけるSMP30を指標とする年齢推定法の確立まで研究を進める予定である。

大鼠肝匀浆经过硫酸铵分级、蔗糖浓度梯度等电聚焦、凝胶过滤和二维电泳后，大鼠SMP30在SDS-PAGE上可纯化为几乎单一的条带。将该大鼠SMP30作为抗原免疫兔子，得到针对大鼠SMP30具有充分效价的抗血清，使用羟基磷灰石柱进行纯化，得到IgG级分。将该 IgG 级分与甲酰纤维素偶联以制备亲和凝胶。将尸检时收集的人肝脏匀浆的硫酸铵级分应用于该亲和柱，并从结合级分中将人SMP30纯化为几乎单一形式。用此处获得的人SMP30作为抗原对小鼠进行足底免疫以产生单克隆抗体，但未能获得具有足够特异性和稳定性的克隆。因此，我们将免疫方法改为腹腔免疫，并再次尝试生产单克隆抗体，但结果与足底免疫的结果几乎相同。这被认为是因为纯化的人SMP30中存在的痕量杂质具有高度免疫原性并阻止针对人SMP30的克隆的激活。因此，我们目前正在通过IEF和二维电泳进一步纯化作为抗原的人SMP30，并以此作为抗原生产单克隆抗体，预计很快就能获得针对人SMP30的单克隆抗体。未来，我们计划继续研究，以实现本研究的最终目标，即建立一种以SMP30为指标的人类年龄估算方法。