アポトーシスを誘導するTIA1の機能の解析

TIA1诱导细胞凋亡的功能分析

基本信息

批准号：
05670938
负责人：
濱田洋文
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Japanese Foundation For Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

腫瘍に対する宿主の抗腫瘍活性を特異的に高めることを目的とした養子免疫遺伝子治療法を開発するためには、特異的な抗腫瘍活性を担う殺細胞Tリンパ球(CTL,cytotoxic T lymphocytes)の働きを増強することがポイントとなる。CTLが標的細胞を殺す機序として重要なものにアポトーシスによる細胞死の誘導がある。本研究では、CTLの抗腫瘍活性を強化することを目標として、CTLから分泌されて標的細胞のアポトーシス誘導に重要な働きをすると考えられるRNA結合タンパクTIA1の機能の解析を行う。本期間中は以下のような実験成果を得た。1.ヒト単球細胞株THP1のmRNAからRT-PCR法を用いて、TIA1のcDNAをクローニングし、コード領域の塩基配列を確認した。2.ヒトTIA1のcDNAのコード領域を大腸菌T7発現ベクターpETヘクローニングし、これを用いてTIA1タンパクを大量に調製した。このタンパクはmRNA(ポリA)に非常に強固に結合することが明らかとなった。3.TIA1のcDNAのコード領域をMoloney murine leukemia virus(MoMLV)から作成・改良したレトロウイルスベクターMFGへ構築した。これをマウス線維芽細胞由来のプロデューサー細胞へトランスフェクトし、タイターの高い組み換えレトロウイルスを作成中である。4.マウスの皮下に移植したB16メラノーマ腫瘍塊から分離したTIL細胞に、in vitroで遺伝子を導入するために基礎実験として以下のような実験を行った。(1)リコンビナイト・ヒトIL-2存在下で、IVS(試験管内抗原刺激法、in vitro stimulation)を行うことにより、B16を特異的に殺すTIL細胞を大量に培養することに成功した。(2)レトロウイルスによるマーカー遺伝子lacZの導入をさまざまな方法により試みたが、TILに対する遺伝子導入効率は1%以下ときわめて低率であった。(3)斉藤泉らの作製したアデノウイルスベクター(Adex1CAlacZ)を用いて、3日目で90%の高効率でTIL細胞にマーカー遺伝子を発現させることができた。(4)現在、マウスIL2、マウスIL7のアデノウイルス発現ベクターを用いて、TILへの遺伝子導入により抗腫瘍活性の強化が図れるかどうかを検討している。これに成功すれば、さらにTIA1のアデノウイルスベクターによる遺伝子導入も試みる予定である。

为了开发一种旨在特异性增强宿主针对肿瘤的抗肿瘤活性的过继性免疫基因治疗方法，需要开发负责特异性抗肿瘤活性增强工作的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。 CTL杀死靶细胞的一个重要机制是通过细胞凋亡诱导细胞死亡。在本研究中，我们将分析CTL分泌的RNA结合蛋白TIA1的功能，该蛋白被认为在诱导靶细胞凋亡中发挥重要作用，旨在增强CTL的抗肿瘤活性。在此期间，我们得到了以下实验结果。 1.采用RT-PCR从人单核细胞系THP1的mRNA中克隆TIA1 cDNA，并确认编码区的核苷酸序列。 2.将人TIA1 cDNA的编码区克隆至大肠杆菌T7表达载体pET中，并利用该载体大量制备TIA1蛋白。研究表明，这种蛋白质与 mRNA (polyA) 结合非常紧密。 3.将TIA1 cDNA编码区构建到逆转录病毒载体MFG中，该载体是由莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)创建并改进的。我们目前正在通过将其转染至小鼠成纤维细胞衍生的生产细胞中来创建高滴度重组逆转录病毒。 4.进行以下基础实验，将基因体外导入从B16黑色素瘤肿瘤块分离的TIL细胞中，皮下移植到小鼠体内。 (1)通过在重组人IL-2存在下进行IVS（体外刺激），我们成功培养了大量特异性杀死B16的TIL细胞。 (2)我们尝试使用逆转录病毒通过各种方法导入标记基因lacZ，但将基因导入TIL的效率极低，不足1%。 (3)使用Izumi Saito等人创建的腺病毒载体(Adex1CAlacZ)，我们能够在第三天在TIL细胞中以90%的高效率表达标记基因。 (4)我们目前正在研究是否可以通过使用小鼠IL2和小鼠IL7的腺病毒表达载体将基因导入TIL来增强抗肿瘤活性。如果成功，我们计划进一步尝试使用 TIA1 腺病毒载体进行基因转移。