未知の遺伝子の機能を生体脳で探る-特定の成熟神経細胞に発現するウイルスベクター

探索活体大脑中未知基因的功能——在特定成熟神经元中表达的病毒载体

• 批准号: 16650071
• 负责人: 幸田 和久
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16650071/
• 关键词: レンチウイルス・ベクター; シンドビス・ウイルスベクター; 小脳; プルキンエ細胞; シナプス可塑性; PDZドメイン; レトロウイルス・ベクター; 顆粒細胞; クモ膜下腔

未知の遺伝子機能を解明するためにウイルスベクターを利用する我々の方略は以下の通りである。目的とする遺伝子の欠損マウスにその遺伝子の変異体を発現させる。これによって、欠損マウスの異常な表現型が回復しなければ、その機能に変異部位が重要な役割を担っていることになる。我々は目的遺伝子としたデルタ2グルタミン酸受容体(δ2)、は小脳平行線維・プルキンエ細胞間のシナプス形成と可塑性に重要な役割を果たしていることがδ2受容体欠損マウスの研究から明らかだが、δ2受容体がグルタミン酸によるチャネル活性を持たないため、その分子としての機能は不明である。まず、レンチウイルスベクターのクモ膜下腔への投与によって、マウス及びラット小脳プルキンエ細胞にGFPをかなり特異的に導入する系を確立した。このベクターを用いて、δ2受容体を発現させようとしたところ、ウイルスベクターの力価が上がらず、個体に投与しても発現が得られなかった。分子量のほぼ等しい、2型グルタミン酸受容体の発現は得られているので、これはδ2受容体特有の現象と考えられる。そこで、我々は、レンチウイルスベクターに代えて、シンドビスウイルスベクターを用いることにした。δ2受容体欠損マウスのプルキンエ細胞に野生型δ2受容体を発現させるとδ2受容体欠損マウスで見られる平行線維-プルキンエ細胞間シナプスの長期抑圧(LTD)の障害が回復した。δ2受容体の最C末端にはPDZドメインがあるが、これを含む7アミノ酸残基の欠失変異体を同プルキンエ細胞に発現させた場合は、LTDは存在するが野生型δ2受容体に比べ、有意に減弱していた。欠損させた7残基のアミノ酸を正常プルキンエ細胞に灌流しても同様の結果が得られた。以上からLTDが正常に生じるためにはδ2受容体がPDZドメインを介して他の分子と相互作用をしていることが必要であることが明らかになった(投稿準備中)。

我们使用病毒矢量阐明未知基因功能的策略如下：在缺乏基因的小鼠中表达了感兴趣基因的突变体。这意味着，如果不恢复缺乏小鼠的异常表型，突变位点在其功能中起重要作用。我们已经表明，Delta2谷氨酸受体（δ2）（感兴趣的基因）在平行小脑纤维和Purkinje细胞之间在突触形成和可塑性中起重要作用，但是其分子功能尚不清楚，因为Δ2受体没有谷氨酸引起的通道活性。首先，建立了一个系统，该系统将GFP引入了小鼠和大鼠小脑Purkinje细胞中，这是通过将慢病毒载体施用到亚蛛网膜下腔空间中的。当使用该载体表达Δ2受体时，病毒载体的滴度也不会增加，即使在给个体给药后也无法获得表达。由于已经获得了具有大致相等分子量的2型谷氨酸受体的表达，因此这被认为是Δ2受体独有的现象。因此，我们决定使用信德氏病毒载体而不是慢病毒载体。来自Δ2受体缺陷型小鼠的野生型Δ2受体的表达恢复了在Δ2受体缺陷型小鼠中看到的平行纤维 - 紫罗兰皮间突触（LTD）的损害。 PDZ结构域位于δ2受体的C端，当含有此的缺失突变体在Purkinje细胞中表达时，LTD与野生型Δ2受体相比显着减弱。当将缺陷的7分配氨基酸灌注到正常的Purkinje细胞中时，获得了相似的结果。从上面可以看出，为了使LTD正常发生，δ2受体必须通过PDZ域与其他分子相互作用（以准备发布）。