イネYAC(酵母人工染色体)ライブラリーの構築と染色体マッピング

水稻YAC（酵母人工染色体）文库构建及染色体定位

基本信息

批准号：
03454039
负责人：
田中國介
金额：
$ 4.1万
依托单位：
Kyoto Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至 1993
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03454039/
关键词：
YACライブラリーイネ P1ライブラリー貯蔵タンパク質プロラミンパルスフィールド電気泳動染色体重複遺伝子低融点アガロースキメラ遺伝子形成 β-アガラーゼ λファージ YACライブラリ-染色体マッピング貯蔵タンパク質遺伝子パルスフィ-ルドゲル電気泳動多重遺伝子族

项目摘要

平成3年度以降イネ染色体構造を明らかにする目的でYACライブラリーの構築を進めている。しかしながら最近キメラ遺伝子の形成が問題化してきたため、平成4年度、平成5年度にかけて挿入断片がやや小型化するものの、キメラ遺伝子形成の割合が少ないP1ライブラリーの構築も進め、YACライブラリーの弱点を補足する試みを行ってきた。P1ライブラリー構築の手法そのものは昨年度末YACライブラリー構築に用いた方法と基本的に同一である。即ち、イネ幼葉より得た高分子量DNAを制限酵素MboI切断した後、パルスフィールド電気泳動(CHEF 170V、15r、パルスタイム3→50秒)を行い80〜100Kb部分を切り出した。beta-アガラーゼによりゲルを分解後、P1ベクターpAd10sacBIIをSacI、BamHI切断して作成したアームにライゲーションした。Pacase,Head/Tailをそれぞれ調節してパケージングした後NS3529株にinfectionしKanamycin入培地上でスクリーニングした。2000ケのP1クローンから得られたDNAについて、プロラミン(RM4、PR10、PR16)およびグルテリン(RG21)に対応するプライマーを設計し、Polymerase Chain Reaction(PCR)により挿入配列の増幅を試みた。その結果予定された長さのDNA断片がアガロース電気泳動で確認できた。また、電気泳動にPCR産物をニトロセルローズ膜へブロティングした後、cDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、RM4(13kDaプロラミン)、PR10(10kDaプロラミン)についてそれぞれ複数グループについてシグナルが確認できた。この結果、イネプロラミン遺伝子を含む長鎖DNA(90Kb)が得られたことになる。今後、プロラミン遺伝子の遺伝子マッピングや、発現機構を染色体レベルで研究するための足がかりとなる。また、YACライブラリーと対応させるための貴重な材料となる。

自1991年以来，我们一直在构建YAC文库，以阐明水稻染色体的结构。然而，近年来，嵌合基因的形成成为了一个问题，因此我们于1992年和1993年着手构建插入片段较小但嵌合基因形成比例较低的P1文库，旨在克服这一弱点。我一直在尝试补充 YAC 库的内容。 P1文库的构建方法与去年年底YAC文库的构建方法基本相同。即，将从稻苗叶获得的高分子量DNA用限制酶MboI消化后，进行脉冲场电泳(CHEF 170V，15r，脉冲时间3→50秒)以切除80-100Kb部分。用β-琼脂酶分解凝胶后，将P1载体pAd10sacBII连接到用SacI和BamHI切割产生的臂上。调整Pacase和Head/Tail并包装后，在含卡那霉素的培养基上感染并筛选NS3529菌株。针对从2000个P1克隆获得的DNA设计对应于谷醇溶蛋白(RM4、PR10、PR16)和谷蛋白(RG21)的引物，并尝试通过聚合酶链式反应(PCR)扩增插入序列。结果，通过琼脂糖电泳确认了预期长度的DNA片段。另外，将PCR产物电泳并印迹到硝酸纤维素膜上后，使用cDNA作为探针进行Southern杂交，结果确认了多个组的RM4(13kDa谷醇溶蛋白)和PR10(10kDa谷醇溶蛋白)的信号。结果，获得了含有水稻谷醇溶蛋白基因的长DNA(90Kb)。这将为未来谷醇溶蛋白基因的遗传图谱及其在染色体水平上的表达机制研究奠定基础。它也将是使其与 YAC 库兼容的宝贵材料。