モレキュラーインプリンティング法による新規バイオマーカー検出法の創案

利用分子印迹法创建新的生物标志物检测方法

• 批准号: 17658066
• 负责人: 松井 利郎
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17658066/
• 关键词: テンプレート; バイオマーカー; 分子捕捉法; ペプチド

HPLC,MSあるいはELISA法等の分析手法に頼ることなく迅速かつ簡便なバイオマーカー検出システムを構築するため、アクリルアミドゲルテンプレートの最適化とジペプチド捕捉性を検討した。1)アクリルアミドゲルの重合条件の設定:マーカー分子として水溶性蛍光試薬である5(6)-carboxyfluoresceinを選択し、アクリルアミドを用いて包摂試験を行った。その結果、5(6)-carboxyfluoroscein(1.2mg)、acrylamide(269mg)、N,N'-methylenebisacrylamide(30mg)、10%ApS(10μl)、5%N,N,N',N'Otetramethylethyldiamine(1μl)混合組成において5(6)-carboxyfluoroscein存在下でのアクリルアミドの重合と特異的捕捉が認められた。2)同ゲルをPVDF膜を装着したマイクロプレート(孔径:0.45μm)内で作製し、20mg/wellのテンプレート形成wellを作製した(室温、24時間)。ゲル硬化後、吸引と脱イオン水による繰り返し洗浄(×3)を行い、蛍光強度として1000以下のテンプレート担体を作製することができた。3)0-100μg/ml濃度の各種5(6)-carboxyfluoresceinを調製し、テンプレートwellに対して自然落下方式により蛍光溶液を浸潤させた。その後、脱イオン水による未吸着成分を脱離処理後、蛍光分析(Ex:485nm、Em:535nm)に供したところ、10μM濃度以上で蛍光強度として10000以上の値を得ることができた。すなわち、本シート材には5(6)-carboxyfluoresceinに対して十分な捕捉領域を有するporeがポリアクリルアミドゲル架橋構造内に形成されていることを示唆しており、テンプレート機能を有した機能担体として活用可能なことを示すことができた。4)Val-Tyr共存、上記最適条件下でアクリルアミドによる重合包摂を行い、Val-Tyr濃度10μMのテンプレートゲルを作製した。遠心処理、吸引して得られたペプチド捕捉性テンプレートに対してVal-Tyrを40nmolまでのスケールで負荷したところ、220nm検出レベルでは十分な捕捉活性が認められなかった。これは、作製ゲルの捕捉容量が10nmolであったことに起因しており、捕捉後のペプチドの蛍光誘導体化等の高感度検出化が必要なことが示唆された。

为了构建快速而简单的生物标志物检测系统，而无需依赖HPLC，MS或ELISA等分析方法，研究了丙烯酰胺凝胶模板和二肽捕获特性的优化。 1）设置丙烯酰胺凝胶的聚合条件：5（6） - 羧基氟氟菌素（一种水溶性荧光试剂）被选为标记分子，并使用丙烯酰胺进行了纳入测试。结果，在存在5（6）个羧基氟菌素（1.2 mg），丙烯酰胺（269 mg），N，N'-甲基双乙烯酰胺（30 mg），10％APS（10μl），5％N，N，N，N'Otemthyyly（1％aps）的情况下，聚合和丙烯酰胺的特定捕获和特定捕获。 作品。 2）配备PVDF膜的微孔板（孔径：0.45μm）制备凝胶，准备20 mg/孔的模板形成孔（室温，24小时）。凝胶固化后，将混合物反复用吸力和去离子水（X3）洗涤，以制备具有荧光强度为1000或更低的模板载体。 3）制备各种5（6）个羧基氟氟氟氟氟氟氟氟化物浓度的浓度，并通过自然滴法用荧光溶液渗入模板井。之后，对具有去离子水的未吸附成分进行解吸并进行荧光分析（例如：485 nm，EM：535 nm），并在10μm或更高的浓度下，获得10,000或更高的荧光强度。也就是说，该材料表明，在聚丙烯酰胺凝胶交联结构中形成了具有足够捕获区域的孔，该孔形成了5（6）个 - 羧基氟氟菌素，表明它可以用作具有模板功能的功能载体。 4）在上述最佳条件下，用丙烯酰胺与丙烯酰胺共存，以准备val-tyr浓度为10μM的模板凝胶。当将Val-Tyr加载到通过离心和抽吸的肽捕获模板上以高达40 nmol的尺度获得的肽​​捕获模板时，在220 nm的检测水平上未观察到足够的捕获活性。这是由于制备凝胶的捕获能力为10 nmol的事实，这表明需要高度敏感的检测，例如捕获后肽的荧光衍生化。