脳内シナプス前神経伝達物質放出関連分子の遺伝子導入および発現阻害法の確立

脑内突触前神经递质释放相关分子基因导入及表达抑制方法的建立

基本信息

批准号：
17650116
负责人：
加藤総夫
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、脳内シナプス前神経細胞への遺伝子導入およびタンパク質発現阻害の方法を確立することであった。この目的は達成され、極めて効率的なin vivo神経節遺伝子発現制御法を確立した。本法は以下の3段階からなる。1.頚部節状神経節への高効率核酸導入麻酔下に頚部節状神経節を露出し、神経節鞘内に核酸溶液を注入後、電気穿孔法によって細胞内に導入した。その結果、最適導入条件下、無視しうるほど僅かな細胞障害で約85%の細胞に核酸を導入することに成功した。2.節状神経節における導入遺伝子発現およびノックダウンの効果の評価核酸導入2-15日後に麻酔下に節状神経節を摘出した。EGFP遺伝子導入群においては、多くの細胞におけるEGFP発現を確認した。また、siRNA導入群においては、遺伝子ノックダウンの標的としてシナプス前で伝達物質放出を抑制するアデノシンA_1受容体の遺伝子を選び、導入の3-12日間持続するアデノシンA_1受容体mRNA量の有意な減少をreal-time RT-PCR法により確認した。この減少は対照のタンパクmRNAにおいては認められず、また、ランダム配列siRNAや溶液のみを導入した群においても認められなかった。3.延髄孤束核におけるシナプス前分子発現抑制効果の評価siRNA導入の11-15日後、孤束核2次ニューロンから記録された孤束1次求心線維刺激誘発シナプス後電流に及ぼすアデノシン(100μM)の効果が有意に減弱した。この減少は、ランダム配列siRNA・溶液導入群においては認められなかった。以上より、節状神経節における遺伝子発現ノックダウンによって、極めて効率的なシナプス前分子機能阻害が可能であることが証明され、その方法が確立された。本法の細部を記した論文を現在投稿準備中であり、公表後は脳科学の進展に大いに貢献すると期待される。

本研究的目的是建立一种将基因导入大脑突触前神经元并抑制蛋白质表达的方法。这一目标得以实现，并建立了一种高效控制体内神经节基因表达的方法。该法由以下三个步骤组成。 1.高效核酸导入颈结节神经节麻醉下暴露颈结节神经节，将核酸溶液注入神经节鞘内，然后通过电穿孔导入细胞。结果，在最佳转染条件下，我们成功地将核酸转染到大约85%的细胞中，并且细胞损伤可以忽略不计。 2.评估结状神经节中的转基因表达和敲低效果在核酸引入后2-15天，在麻醉下切除结状神经节。在EGFP基因导入组中，在许多细胞中确认了EGFP表达。此外，在引入siRNA的组中，我们选择抑制突触前递质释放的腺苷A_1受体基因作为基因敲低的目标，发现腺苷A_1受体mRNA的量显着减少，持续3至12年。引入后几天通过实时RT-PCR方法得到证实。在对照蛋白mRNA中没有观察到这种减少，在引入随机序列siRNA或单独溶液的组中也没有观察到这种减少。 3. 引入 siRNA 11-15 天后，评估抑制孤立束核内突触前分子表达的效果，腺苷 (100 μM) 对束初级传入纤维刺激引起的突触后电流的影响从孤立束核的次级神经元记录的孤束症效果显着减弱。在随机序列siRNA/溶液引入组中没有观察到这种减少。由上可知，通过敲低结状神经节中的基因表达，可以极其有效地抑制突触前分子功能，并且已经建立了其方法。一篇描述该方法细节的论文目前正在准备提交，预计一旦发表将极大地促进脑科学的进步。