P2X受容体発現細胞を用いた脳組織細胞外ATP放出イメージング法の開発

使用 P2X 受体表达细胞开发脑组织细胞外 ATP 释放成像方法

基本信息

批准号：
15650071
负责人：
加藤総夫
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

脳組織におけるATPの細胞外放出をイメージングによって検証することが本研究の目的であった。昨年度、P2X_2受容体を発現させたHEK293T細胞がATP変化を検出し得るか検討したが、投与された外因性ATPに対する応答は長く持続的で、時間的な分解能が著しく低いこと、また、細胞間の発現効率の差のために十分な空間分解能が得られないことが判明した。以上より、細胞外代謝の速いATP濃度の変化を画像化するには、この方法は不適切であると結論した。そこで、本年度は新しい二つの試みを計画し実行した。第1は、超高感度光子検出カメラとluciferin-luciferase反応を用いて脳スライスにおける細胞外ATPを検出する試みである。海馬、大脳皮質、孤束核スライスにおいて電気刺激によるATP放出を画像化し得た。電気刺激による細胞外ATP濃度上昇は、(1)刺激電極の近傍に限局し、軸索終末近傍では観察されない、(2)テトロドトキシンによって消失しない、そして、(3)高K+濃度刺激によっては生じないことが明らかになった。これらは、脳スライスで電気刺激によってATPが放出されるとする現在までの報告の多くに重大な疑義を投げかける重要な結果である。第2は、バイオセンサーを用いた脳組織内局所的ATP濃度のリアルタイム計測である。同センサーは、2004年度までは開発国イギリス国内でしか使用できないという特許規定があったこと、また、開発者がヴェンチャー企業を設立し輸入手続に時間がかかったことなどから、研究代表者のもとに同センサーが届いたのは2005年1月であった。現在、同センサーを用いた脳スライスにおける細胞外ATP計測の実験を進行中である。以上より、本萌芽研究の目的は、当初の実験手法を変更したが、新たな方法を漸次採用することによって果たされ、萌芽段階ではない研究に進展しつつある。

本研究的目的是通过成像验证脑组织中ATP的细胞外释放情况。去年，我们研究了表达P2X_2受体的HEK293T细胞是否可以检测ATP的变化，但我们发现对外源ATP的反应是长期且持续的，并且时间分辨率极低，无法获得足够的空间分辨率。表达效率的差异。综上所述，我们得出结论，该方法不适合对细胞外代谢过程中 ATP 浓度的快速变化进行成像。因此，今年我们计划并实施了两项新的实验。第一个是尝试使用超灵敏光子检测相机和荧光素-荧光素酶反应来检测脑切片中的细胞外 ATP。我们能够对海马、大脑皮层和孤束核切片中电刺激诱导的 ATP 释放进行成像。由电刺激引起的细胞外ATP浓度的增加是(1)局部化在刺激电极附近并且在轴突末端附近未观察到，(2)不被河豚毒素消除，并且(3)不是由高K + 浓度刺激引起。清除。这些重要的结果对迄今为止许多有关大脑切片电刺激释放 ATP 的报告提出了严重质疑。二是利用生物传感器实时测量脑组织局部ATP浓度。直到2004年，这种传感器的专利规定只能在其开发国家英国使用，而开发商已经成立了一家合资公司，进口手续需要时间才能在2005年1月到达。我们目前正在进行实验，使用相同的传感器测量脑切片中的细胞外 ATP。如上所述，虽然改变了原有的实验方法，但通过逐步采用新的方法，达到了本次探索性研究的目的，并且研究正在超越探索阶段。