変形性関節症で誘導される軟骨特異的遺伝子CILPのプロモーター解析

骨关节炎诱导的软骨特异性基因CILP的启动子分析

基本信息

批准号：
16659399
负责人：
池田敏之
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659399/
关键词：
CILP SOX5 SOX6 軟骨分化 p63

项目摘要

1.CILPの成長軟骨における発現パターンの解析前年度作成した抗CILPポリクロナール抗体の特異性をCILPの強制発現系を用いて確認した。N末端側、C末端側の両エピトープにおいてペプチド抗体を作成したが、作成した抗体はウェスタンブロッティングにおいて感度、特異度とも間題なかったため、発生肢において免疫染色を行いその局在をみた。組織レベルの解析と同様CILPの発現は成長軟骨および筋肉に強く認めた。とくに軟骨においては増殖軟骨細胞層から前肥大軟骨細胞層にシグナルが検出され、SOX5/6の発現パターンにオーバーラップしていた。2.CILPの転写活性化に働く新規分子のクローニング前年度にしぼりこんだDSOXRE1を3コピー重ねたDNA配列をベイトにヒト軟骨、マウスエンブリオ由来のcDNAライブラリーを用いてワンハイブリッドアッセイ、およびサウスウェスタンスクリーニングを行って結合転写因子の候補を得た。得られた約30個の候補分子のうちp63とZNF18がCILPのプロモーターを特異的に活性化した。SOX5、SOX6との直接の協調的な作用は明らかではなく、さらに他の分子が介在している可能性が高いが、p63はHeLa細胞に単独でCILP mRNAを誘導可能であるばかりでなく、II型コラーゲン、SOX6、SOX9などさまざまなプロモーターの転写を活性化した。また、ZNF18はCILP以外の軟骨特異的遺伝子への反応性は小さかったが、抗アポトーシス分子であるBCL2のプロモータに高い反応性を示し、このさいp63と協調的に作用した。SOXトリオの抗アポトーシス作用の一部はp63やZNF18との協調作用によって生じている可能性が示された。

1.生长软骨中CILP表达模式的分析使用CILP强制表达系统证实了前一年创建的抗CILP多克隆抗体的特异性。针对 N 端和 C 端表位生成了肽抗体，但这些抗体在蛋白质印迹中具有良好的敏感性和特异性，因此对发育中的肢体进行免疫染色以确定其定位。与组织水平分析类似，在生长的软骨和肌肉中强烈观察到 CILP 表达。特别是，在软骨中，检测到从增殖软骨细胞层到肥大前软骨细胞层的信号，其与SOX5/6的表达模式重叠。 2. 克隆作用于 CILP 转录激活的新分子使用源自人类软骨和小鼠胚胎的 cDNA 文库，使用包含 3 个 DSOXRE1 拷贝的 DNA 序列进行杂交测定，该序列在前一年已缩小范围，如下所示诱饵，并进行西南A筛选以获得结合转录因子的候选物。在获得的大约 30 个候选分子中，p63 和 ZNF18 特异性激活 CILP 启动子。虽然与SOX5和SOX6的直接协同作用尚不清楚，并且很可能有其他分子参与，但p63不仅可以单独诱导HeLa细胞中的CILP mRNA，还可以诱导HeLa细胞中的IILP mRNA激活各种启动子的转录。例如胶原蛋白、SOX6 和 SOX9 型。此外，尽管ZNF18对CILP以外的软骨特异性基因的反应性较低，但它对抗凋亡分子BCL2的启动子表现出高反应性，并在这种情况下与p63协同作用。结果表明SOX trio的部分抗凋亡作用可能是通过与p63和ZNF18的协同作用引起的。