TNFスーパーファミリーを利用した軟骨再生薬開発のための基礎研究

利用TNF超家族开发软骨再生药物的基础研究

基本信息

批准号：
22K09348
负责人：
池田敏之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09348/
关键词：
軟骨分化サイトカイン TNFスーパーファミリー

项目摘要

ヒト間葉系幹細胞を用いたin vitro 軟骨分化モデルの構築を行った。４種類のTNFスーパーファミリー分子LTA、TRAIL、VEGI、GITRLについて293細胞にアデノウィルスベクターを導入パッケージング、発現を確認した。LTAについては、パッケージングに時間がかかり現在効果検証中、VEGIについては発現に問題がありベクターの再構築が必要であった。一方GITRLとTRAILについてはヒトMSCに導入した場合、導入後１週間程度の早期からCOL2A1, SOX6, SOX9など軟骨の初期分化マーカーのmRNA誘導と、ALP染色陽性、alcian blue 染色陽性で示される軟骨基質の産生を認め、強い軟骨誘導能を認めた。とくにGITRLについてはパネルRNAを用いたRT-PCRによる解析で軟骨組織・軟骨細胞にかなり特異的に高発現していることが確認され軟骨分化誘導薬の候補として有望ではないかと考えられた。特異的受容体であるGITRの発現も同様に軟骨特異的であったためGITRのアデノウィルス発現系を作成したところGITRもヒト間葉系細胞を軟骨細胞様に分化させることが明らかになった。GITR/GITRLの組み合わせでさらに軟骨分化は促進された。市販の精製済みGITRLを使用して軟骨分化に必要な濃度を検証したところGITRLは従来の生理的な活性濃度よりかなり高濃度の100 ng/mL程度で軟骨分化誘導を促すことが明らかになった。現在リガンド・リセプターにGFPを挟みこんだ形の強制発現系を作成し恒常活性型の軟骨分化誘導因子としてワークするか検証中である。また末梢血由来の単核球分画にNFkBシグナルの転写因子RELAをアデノウィルスで導入すると間葉系幹細胞様の紡錘形細胞に一部分化することが分かったので、この細胞を増殖させたin vitro軟骨分化モデルを現在作成中である

我们利用人间充质干细胞构建了体外软骨分化模型。将腺病毒载体引入293细胞，以确认四种类型的TNF超家族分子LTA、TRAIL、VEGI和GITRL的包装和表达。对于LTA，包装需要时间，目前正在验证功效，而对于VEGI，表达存在问题，需要重建载体。另一方面，当GITRL和TRAIL被引入人MSC中时，早在引入后一周就发生早期软骨分化标记物如COL2A1、SOX6和SOX9的mRNA诱导，并且软骨基质以阳性显示观察到ALP染色和阿新蓝染色阳性，观察到较强的软骨诱导能力。特别是，通过使用组RNA的RT-PCR分析，证实GITRL在软骨组织和软骨细胞中高表达，并被认为是软骨分化诱导药物的有希望的候选者。由于特异性受体GITR的表达也是软骨特异性的，因此我们创建了GITR的腺病毒表达系统，发现GITR也能将人间充质细胞分化为软骨细胞样细胞。 GITR/GITRL的组合进一步促进软骨分化。当我们使用市售的纯化 GITRL 验证软骨分化所需的浓度时，我们发现 GITRL 在比常规生理活性浓度高得多的浓度（约 100 ng/mL）下诱导软骨分化。我们目前正在创建一种强制表达系统，其中 GFP 夹在配体和受体之间，并正在研究它是否可以作为组成型活性软骨分化诱导因子。此外，我们发现，当使用腺病毒将NFkB信号转录因子RELA导入外周血来源的单核细胞时，它们部分分化为间充质干细胞样纺锤形细胞，目前正在创建模型。