アログラフト炎症因子-1の細胞工学的制御による先端的移植心動脈硬化治療法の開発

通过细胞工程控制同种异体移植物炎症因子-1开发先进的心脏动脉粥样硬化移植疗法

基本信息

批准号：
15659288
负责人：
藤井聡
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

研究室で樹立したマクロファージ系細胞にAIF-1を強制発現させたトランスジェニックマウスを用いて検討を進めた。(1)トランスジェニックマウスから抽出した腹腔マクロファージを用い蛍光標識したマイクロビーズおよび大腸菌の貪食能をフローサイトメトリー法による解析や分光吸光度計で評価した。AIF-1の発現量に比例して貪食能の亢進が認められ、AIF-1が細胞骨格に作用する機構を知る重要なモデルと考えられた。同定したマウスAIF-1の遺伝子配列を元に抗AIF-1 siRNAを合成し、AIF-1の抑制を行った。siRNAを作用させたマクロファージ系細胞株で貪食能の低下が認められ、貪食機能の調節におけるAIF-1の作用が明確となった。(2)動脈硬化とAIF-1の関係を検討するため、動脈硬化モデルマウスのApo E^<-/->マウスとAIF-1トランスジェニックマウスを交配しApo E^<-/-> AIF-1強発現マウスを作製した。このモデルマウスに通常食を食べさせ15週後に動脈硬化巣の面積を定量解析し対照群と比較した。Apo E^<-/-> AIF-1強発現マウスでApo E^<-/->マウスより動脈硬化の進展傾向が認められた。動脈硬化病巣形成にはマクロファージの貪食、泡沫化が深く関与しており、AIF-1がその貪食機能を調節する分子であることから、AIF-1は動脈硬化病巣進展を制御するメカニズムの一つと考えられた。AIF-1を強発現させた動脈硬化モデルマウスにおいては動脈硬化の進展が認められたため、今後は免疫組織化学染色によって病巣でのAIF-1の存在をより明確に証明すると同時に、マイクロダイセクション装置を用い、動脈硬化巣をスライド切片より選択的に切り出し、抽出したRNAを用いてリアルタイムPCRを行い病変部のサイトカインバランスの変化を確認する予定である。以前AIF-1を強制発現させたマクロファージ系細胞株をLPS刺激した際に動脈硬化抑制性サイトカインIL-6、IL-10の産生と動脈硬化促進性サイトカインIL-12の産生が亢進することを報告した。AIF-1強発現群で動脈硬化進展が認められ、AIF-1の存在が貪食以外に局所のサイトカインバランスを変化させている可能性がある。このことを確認するために、病巣局所のサイトカイン産生を強発現群と対照群で比較検討することは重要なので検討していく。

我们使用在实验室建立的巨噬细胞中强制表达AIF-1的转基因小鼠进行了研究。 (1)使用从转基因小鼠中提取的腹腔巨噬细胞，通过流式细胞术分析和分光光度法评估荧光标记微珠和大肠杆菌的吞噬作用。观察到吞噬作用与 AIF-1 表达量成比例增加，这被认为是了解 AIF-1 作用于细胞骨架的机制的重要模型。根据鉴定的小鼠AIF-1基因序列合成抗AIF-1 siRNA，并抑制AIF-1。在用 siRNA 处理的巨噬细胞系中观察到吞噬作用下降，阐明了 AIF-1 在调节吞噬功能中的作用。 (2)为了研究动脉硬化与AIF-1之间的关系，我们将动脉硬化模型小鼠Apo E^-/->小鼠与AIF-1强表达转基因小鼠进行杂交。对该模型小鼠进行正常饮食喂养，15周后对动脉硬化病变面积进行定量分析，并与对照组进行比较。 Apo E^-/-AIF-1强表达小鼠比Apo E^-/-小鼠更容易发生动脉硬化。巨噬细胞的吞噬作用和泡沫形成深入参与动脉粥样硬化病变的形成，而AIF-1是调节吞噬功能的分子，因此AIF-1被认为是控制动脉粥样硬化病变进展的机制之一。有人这么想。由于在强表达AIF-1的动脉硬化模型小鼠中观察到动脉硬化的进展，因此我们将使用免疫组织化学染色来更清楚地证明病变中AIF-1的存在，同时我们计划使用显微切割装置进行选择性切割。使用该方法从切片中取出动脉硬化病变，并使用提取的RNA进行实时PCR以确认病变中细胞因子平衡的变化。此前，我们报道过，当用LPS刺激强制表达AIF-1的巨噬细胞系时，抗动脉粥样硬化细胞因子IL-6和IL-10以及促动脉粥样硬化细胞因子IL-12的产生增强。做过。在AIF-1强表达组中观察到动脉硬化的进展，这表明AIF-1的存在除了吞噬作用之外还可能改变局部细胞因子平衡。为了证实这一点，对强表达组和对照组之间局部细胞因子产生进行比较研究很重要，因此我们将继续这样做。