エンドサイト-シス小胞形成のリアルタイム観察

实时观察内吞顺式囊泡形成

基本信息

批准号：
15657028
负责人：
竹居孝二
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ファゴサイトーシスの分子機構解明のために、セルトリ細胞を用いてファゴサイトーシスのリアルタイム観察を行った。まず、セルトリ細胞株SerW3にフォスファチジルセリン(PS)を認識する受容体(SR-B1)が発現していることをウエスタンブロットにより確認し、細胞膜における局在のパターンを蛍光免疫染色により明らかにした。次に、SerW3細胞によるPS含有大型リポゾーム取込みを経時的、定量的に調べることにより、セルトリ細胞のファゴサイトーシスが、SR-B1を介してPS依存性に起こることを明らかにした。SerW3細胞に、PS含有リポゾームあるいはPSで被覆したスチレンビーズを貪食させ、その様子を超高速共焦点レーザー顕微鏡下でリアルタイム観察したところ、ファゴサイトーシスにおけるpseudo pod形成に先立って糸状突起やラッフルの形成など、F-アクチンの再編成による細胞膜の形態変化が著明に認められた。PS刺激からアクチン重合、ラッフル形成にいたる経路には、フォスファチジルイノシトール3リン酸キナーゼ、Rac、cdc42が関与することが阻害剤を用いた実験により示された。GFP-アンフィファイジン1を発現させたSerW3細胞をライブイメージングにより観察すると、ラッフル形成に伴ってアンフィファイジン1がラッフルに集積する様子が認められた。SerW3細胞のアンフィファイジン1をRNAiによりノックダウンするとラッフル形成が抑制されたことから、アンフィファイジン1がファゴサイトーシス初期におけるアクチンフィラメントの再編成に関与することが示唆された。

为了阐明吞噬作用的分子机制，我们使用支持细胞对吞噬作用进行了实时观察。首先，我们通过蛋白质印迹证实支持细胞系 SerW3 表达识别磷脂酰丝氨酸 (PS) 的受体 (SR-B1)，并通过荧光免疫染色揭示其在细胞膜中的定位模式。接下来，通过定量检测 SerW3 细胞随时间对含 PS 大脂质体的摄取，我们发现支持细胞吞噬作用通过 SR-B1 以 PS 依赖性方式发生。当用含PS的脂质体或涂有PS的苯乙烯珠吞噬SerW3细胞时，并在超快共聚焦激光显微镜下实时观察该过程，在吞噬过程中观察到丝状和褶边的形成，然后形成假荚。观察到由于 F-肌动蛋白重组导致的细胞膜形态的显着变化。使用抑制剂的实验表明，磷脂酰肌醇三磷酸激酶、Rac 和 CDC42 参与从 PS 刺激到肌动蛋白聚合和皱褶形成的途径。当通过实时成像观察表达GFP-两性蛋白1的SerW3细胞时，观察到随着褶边形成，两性蛋白1在褶边中积累。通过 RNAi 敲除 SerW3 细胞中的两栖蛋白 1 可抑制皱褶形成，表明两栖蛋白 1 参与吞噬作用早期阶段肌动蛋白丝的重组。